本文是一篇药学论文，本研究发现临床铜绿假单胞菌对含β-内酰胺结构的抗生素的耐药提升可能是适应性定殖的必然趋势，慢性呼吸道感染中铜绿假单胞菌的耐药发展与lasR进化存在偶联的关系。
第一章 绪论
1.1 选题背景与意义
随着人口老龄化与大气污染问题的加剧，慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的发病率在世界范围内呈增加趋势[1]。世界卫生组织统计，2019年COPD造成了323万人死亡，成为全球第三大死因。中国疾病预防控制中心统计数据显示， 2020 年新冠疫情全国封闭的背景下，COPD造成的死亡率占全国总死亡人数的 7.43%，在非传染性疾病中排名第五[2]，给国家医疗系统带来了巨大的财政负担。
COPD急性加重(Acute exacerbation of COPD, AECOPD)最常见的原因是由细菌(40-60%)、病毒(约30%)引起的感染[3, 4]。持续性感染带来的炎症、组织损伤的重复循环导致患者肺功能迅速下降，肺微生物组、免疫功能异常和病原体毒力是COPD获得性肺炎发病的最危险因素[5-7]。铜绿假单胞菌是COPD患者中分离到的常见致病菌，是与 COPD 患者病情恶化最相关的病原体[8, 9]。2021年中国细菌耐药监测结果报道[10]，铜绿假单胞菌的临床分离率占呼吸道标本分离菌的第3位，在支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)标本分离菌中占第1位，如图1.1所示。铜绿假单胞菌相对较大的基因组、复杂的调节网络、广泛的代谢能力以及表达多种毒力决定簇的能力使其能够迅速响应和适应外部环境变化，定殖于COPD病灶环境的铜绿假单胞菌往往很难被清除[11, 12]。由于不得不频繁使用抗生素的干预，COPD患者的慢性呼吸道病灶成了多重耐的铜绿假单胞菌(multidrug-resistant，MDR)的发源地。《新冠肺炎对抗生素耐药性的影响特别报告》已将多重耐药的铜绿假单胞菌列为严重威胁的范畴，与2019年相比，2020年医院发病MDR-PA增长了32%，急需采取干预措施[13]。铜绿假单胞菌的适应性和获得耐药性的能力强大，可以预见未来传统抗生素对铜绿假单胞菌的治疗作用将微乎其微。
药学论文参考
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1.2 文献综述
1.2.1 铜绿假单胞菌的生态学描述与致病机制
铜绿假单胞菌是一种长约1-5 μm，宽约0.5-1.0 μm的杆状、单鞭毛革兰氏阴性细菌。
作为分解者，铜绿假单胞菌的最佳代谢方式是有氧呼吸，同时它也可以通过硝酸盐或其他替代电子受体进行厌氧呼吸。铜绿假单胞菌可以分解代谢包括苯甲酸盐等多种有机化合物，其惊人的营养多样性使其成为了一种在土壤、水、人类、动物、植物中普遍存在的微生物[14]。19世纪末，在巴斯德开发无菌培养基之后，铜绿假单胞菌首次被描述为一种独特的细菌物种，其最适生长温度为37℃，在42℃下也能生长，还能够产生独特的氨基苯乙酮气味，通常在血琼脂上有清晰的溶血区。2000年，加州大学首次发表了铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1的完整基因组序列，并提供了铜绿假单胞菌在生态、遗传多样性方面的新信息，这是细菌基因组有史以来最大的测序[15]。在其基因组的6,264,403个碱基对中，包含了5,570个预测的开放阅读框(open reading frame, ORF)。PAO1基因组序列几乎具有能与简单真核生物相较的的遗传复杂性，例如酿酒酵母。
作为病原体，铜绿假单胞菌的致病性来源于其分泌的毒力因子对宿主造成的细胞以及组织损伤。铜绿假单胞菌利用其鞭毛、菌毛粘附在组织表面，通过复制增殖分泌许多毒力因子来实现定殖[16, 17]。这些外毒素在铜绿假单胞菌被抗生素杀死后仍会继续影响宿主并危及生命，表1.1总结了部分毒力因子及其病理作用[19]。例如，铜绿假单胞菌产生的蛋白质外毒素A影响蛋白质核糖基化过程，从而抑制宿主细胞的蛋白质合成。铜绿假单胞菌产生的弹性蛋白酶LasB是一种胞外锌蛋白酶，会攻击真核蛋白质，如胶原蛋白和弹性蛋白，并破坏细胞的结构蛋白，还分解人免疫球蛋白和血清α蛋白。此外，这种弹性蛋白酶还能通过抑制单核细胞趋化性实现一定程度的免疫逃逸[18]。同时铜绿假单胞菌种群中存在多种内在和获得性耐药机制[20]，内在抗性机制包括：外膜低通透性(低于大肠杆菌12 到 100 倍)、抗生素外排系统、抗生素修饰酶、抗生素灭活；获得性耐药机制包括:水平基因转移，例如获得可转移的氨基糖苷类修饰、自突变获得耐药，例如外排泵和β-内酰胺酶的过度表达，以及抗生素靶点和孔蛋白的表达减少或修饰改变[21-24]。
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第二章 临床铜绿假单胞菌的分离与表型鉴
2.1 引言
表型(Phenotype)是遗传物质的自然表达，基因型(Genotype)则是导致特定表型的遗传物质的化学组成，表型变异是自然选择进化的基本先决条件。最开始的适应性定殖讨论从表型开始，表型的变化可以从量变的角度反映出临床菌株适应性定殖过程中的质变情况。铜绿假单胞菌表型特质是丰富多样的，已有不少关于铜绿假单胞菌表型实验的方法可以参考[52]。先前的文献研究表明，铜绿假单胞菌在CF感染的过程中都朝着退行性进化的方向收敛。在急性感染期间，病原体和宿主之间的关系是相互破坏的，铜绿假单胞菌产生的各种细胞毒性分子会损害宿主细胞过程，运动性强的菌株表现出毒性的更强。[53]。最常见的表型变化就是的铜绿假单胞菌在CF肺的定殖过程中经历了从需氧微生物到厌氧微生物的转变，使其生长状态由浮游模式转变为固着模式[54]。为了适应环境抵御不利条件，铜绿假单胞菌在鞭毛、菌毛、Ⅲ型分泌系统等多元件参与下[55]，转换到固着的生物膜内增殖的模式，铜绿假单胞菌生物膜内增殖创造了使细菌能够进行强烈的细胞间相互作用和交流一个生态位，并形成一个新陈代谢物质、营养物质和能量的储存库，以促进生长，具有极高的持久抵抗吞噬作用、氧化应激、营养限制、代谢废物积累、种间竞争和常规抗菌剂的能力，同时在长期定殖中会分化出一些低毒力的亚群，这些亚群会丧失部分外泌胞外蛋白酶、绿脓菌素等毒力因子的能力[56]。
为了观察铜绿假单胞菌在COPD患者中的动态进化过程，我们同样需要对分离到的菌株进行多角度的表型评价，包括运动能力，代谢水平，毒力因子表达情况，耐药性。同时，由于临床菌株分离的实际操作过程中因为传代复制的过程中出现取样重复的情况，对菌株进行表型上的筛选鉴定，可以简化实验样本为后续实验开展做铺垫。基于上述，本章首先通过对COPD来源的呼吸道样本进行了菌株的分离鉴定工作。随后对分离到的铜绿假单胞菌的绿脓菌素产量、生物膜产量、运动能力、胞外蛋白水解酶、粘液样转化情况以及腺苷利用能力进行了定量或定性的评价，并通过肠道细菌重复基因间共有序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)扩增分析临床菌株的遗传亲缘关系。
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2.2 实验材料
2.2.1 实验菌株与呼吸道样本
本研究从2020年10月起累计招募了15例在成都大学附属医院住院的COPD患者(年龄范围为60-92，平均年龄为70岁)，铜绿假单胞菌检出均为阳性。每隔约两周收集患者BALF或者自发性痰液样本，并对样本中的铜绿假单胞菌进行了纵向采集，取样时间节点如图2.1所示，具体病人病症及采样信息见表S2.1。其中有5位病人是多次取样，其余病人由于出院等不可控因素退出了项目，只进行了1-2次取样。后续实验对分离到的全部菌株表型都进行了横向普查，并对持续取样的C、W、L、M四位病人的菌株表型变化进行了纵向分析。
本章实验所用的对照菌株为本实验室保藏的野生型PAO1。
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第三章 基因组测序与转录组分析..........................31
3.1 引言.....................................31
3.2 实验材料..............................31
第四章 线虫感染模拟与小鼠慢性感染模拟............................46
4.1 引言.......................................46
4.2 实验材料...............................46
结论...............................56
第四章 线虫感染模拟与小鼠慢性感染模拟
4.1 引言
铜绿假单胞菌通过基因变化和生物膜形成适应COPD患者的呼吸道，这可能是导致持续感染和抗生素耐药性的原因。在本研究中，虽然随着COPD定殖时间的推移，逐个分析铜绿假单胞菌分离株的全局转录模式发生了变化，但在群体水平上并没有被明显体现出来，最典型的就是铜绿假单胞菌QS相关功能的表现出的下降趋势，在群体水平中并没有被检测到。本研究推测，这可能是因为COPD背景下的铜绿假单胞菌通常是由多个亚群组成的，而不是像CF肺被单一克隆定殖。由来自不同谱系并携带多种突变的铜绿假单胞菌造成了群体中更加复杂的遗传结构，包括QS完整和缺陷个体。因此本研究通过使用铜绿假单胞菌W1a (QS完整型)、W1c (QS缺陷型)及其混合物(1:1)建立慢性感染模型，以检测不同铜绿假单胞菌种群对宿主的影响。
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结论
铜绿假单胞菌具有相对较大基因组，拥有复杂的代谢调控网络是临床上重要的条件致病菌，铜绿假单胞菌可以在免疫功能低下的宿主中引起感染，并且可以进化出多种能力以持续定殖宿主的呼吸道。CF和COPD是两种常见的呼吸系统疾病，常伴有铜绿假单胞菌感染。CF和COPD都以呼吸道炎症、粘液纤毛清除减少、呼吸道反复感染为特征，但两种疾病发病机制和发病时间的差异决定了铜绿假单胞菌进化的肺环境可能不同。虽然铜绿假单胞菌被认为与 COPD 的反复急性加重密切相关，但很少有研究关注 COPD 呼吸道中铜绿假单胞菌的适应性进化。
通过综合分析从 COPD 患者支气管肺泡灌洗液中纵向采集的铜绿假单胞菌的表型、遗传和功能变化，本研究发现，COPD 呼吸道更容易被来自不同谱系的铜绿假单胞菌定殖而不是被单一菌株垄断，并且这些谱系可以在与病人中共存直到结束病人的生命。基于 SNP 的系统发育分析和分型本研究进一步证明，新铜绿假单胞菌克隆的入侵归因于医院内患者间传播。多克隆铜绿假单胞菌在同一COPD呼吸道共存可能与患者年龄较大和健康状况不佳有关。肺部环境的复杂性以及免疫力下降使新的菌株能够入侵并在病灶环境中持续性定殖。来自不同谱系的铜绿假单胞菌在同一患者中独立进化，在遗传或转录水平上没有明显的趋同适应趋势，进化分离株的功能变化与整个种群的功能变化明显不一致。这是由于铜绿假单胞菌群体中毒力基因的表达随着感染时间的延长而动态变化，并且会受到QS系统完整和缺陷个体比例变化的影响。
参考文献（略）