本文是一篇药学论文，本文首次发现熊果酸及其衍生物在体外能够抑制PRRSV的复制，为研发新型的抗PRRSV药物提供了实验依据。
1 前言
1.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种传染性疾病，也是养猪行业中的一种常见疾病，该病以母猪繁殖障碍、仔猪生长性能差和呼吸困难为特征，各个年龄段的猪均能发病，发病猪的主要临床症状包括全身出现出血点、发热、呼吸困难和耳朵变蓝，又被称为猪“蓝耳病（Blue-eared pig disease）”（Done et al., 1995；Botner et al., 1997；Montaner-Tarbes et al., 2019）。1987年，该病第一次在美国被发现，接着1990年在欧洲也被发现（Mateu et al., 2008），1995年，国内爆发流行PRRS，从发病猪场中分离出4株PRRSV，经血清学实验和间接免疫荧光实验证明4个毒株的基因型与北美型PRRSV相似，从而证实了我国存在PRRS（郭宝清等，1996）。2006年初我国出现了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），影响了200多万头猪，该病的特征是所有年龄段的猪均表现高烧（41℃）、高发病率（50％～100％）和高死亡率（20％～100％）（An et al., 2010），随后在老挝、越南（Ni et al., 2012）、泰国（Nilubol et al., 2012）等国家也发现了HP-PRRSV。根据美国养猪行业估计，每年与PRRS相关的损失约为6.64亿美元（Khatun et al., 2019）。目前，世界上大部分国家的养猪业都出现了PRRS，对全球的养猪行业造成了重大的经济损失。世界动物卫生组织将PRRS列为B类疾病，《中华人民共和国动物防疫法》将经典的PRRS列为二类动物疫病，HP-PRRS列为一类动物疫病（吴倩倩，2016）。
............................
1.2 猪繁殖与呼吸综合征的防治
1.2.1 疫苗预防
关于PRRSV疫苗的使用仍然存在争议性。一方面，从临床观察来看，疫苗的有效性不高或不显著；另一方面，目前PRRSV在猪场普遍存在。在中国，市面上有7种以上的PRRSV疫苗(CH-1a/CH-1R、VR2332/Ingelvac PRRS MLV、R98/R98 MLV、JXA1/JXA1-r、TJ/TJM-F92、HuN4/HuN4-f112、GD/GDr180等)，这些疫苗在减少临床症状、减少病毒血症和缩短病毒清除时间方面是有效的，它们可以对各自的PRRSV感染提供有效的保护，以应对致命的挑战（Han et al., 2009；Tian et al., 2009；Leng et al., 2012；Wei et al., 2013；Bonckaert et al., 2016；Wang et al., 2016）。然而，它们不能完全预防感染和建立完全免疫。而且，疫苗的有效性在面对不同亚型PRRSV感染挑战时明显下降，只能提供部分或有限的保护（Bai et al., 2016；Zhang et al., 2016；Zhou et al., 2017）。2006年HP-PRRSV的暴发是在CH-1a和Ingelvac PRRS MLV疫苗接种的背景下发生的。自2013年以来，尽管大规模接种了所有商业疫苗，但类似于NADC30的病毒株在中国猪场间仍然持续传播。使用弱毒活疫苗进行大规模疫苗接种也会导致安全问题和更多的遗传差异，（1）已经证明，疫苗病毒可以从接种过疫苗的猪传染到未接种过疫苗的猪，这表明它们有能力在田间传播，并形成不同的疫苗相关群（Nielsen et al., 1997；Mengeling et al., 1999）；（2）广泛的免疫压力可能是促进我国北美型遗传多样性的主要动力之一（Zhou et al., 2014）；（3）疫苗衍生物具有还原成有致病力的病毒的可能（Bian et al., 2017）；（4）重组的频率不断增加，特别是NADC30-like病毒株的出现，表现出与HP-PRRSV（JXA1）、经典PRRSV（CH-1a和VR2332）和弱毒疫苗（JXA1-P80和TJM-F92-like）广泛的重组能力（Li et al., 2016；Wang et al., 2016；Bian et al., 2017；Zhao et al., 2017）。已经证实，重组病毒株与2009年至2010年间HP-PRRSV的流行有关，并且自2013年以来与中国NADC30-like病毒的大流行密切相关（Shi et al., 2013；Zhao et al., 2015）。因此，兽医和养猪人员变得更加谨慎，并重新评估以前的免疫策略。一些养猪业的人员试图通过采取其他综合防治措施来减少和抑制PRRSV在中国的传播。
................................
2 材料与方法
2.1 主要药物与试剂
熊果酸（Ursolic Acid，UA）及其衍生物由华南农业大学材料与能源学院制药工程系宋高鹏老师课题组合成赠送，熊果酸纯度98％，compound-9纯度98.5％，批号2018.04.20，compound-12纯度98％，批号2018.04.29，熊果酸衍生物1-15结构如图5所示；利巴韦林（Ribavirin，Rib）购买自广东肇庆星湖生物化学制药厂，纯度98.5％，批号L040328；胎牛血清（FBS）购买自Biological Industries公司；DMEM细胞基础培养基购买自Gibco公司；0.25％ EDTA-胰酶购买自Biosharp公司；注射用硫酸链霉素购买自瑞阳制药有限公司；注射用青霉素钠购买自中诺药业有限公司；四甲基噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购买自美国Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）购买自碧云天生物科技公司；总RNA极速抽提试剂盒购买自上海飞捷生物技术有限公司；反转录反应预混反应体系和2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系购买自北京康润诚业生物科技有限公司；特异性引物都是由上海生工生物工程股份有限公司合成。
药学论文怎么写
................................
2.3 主要仪器与耗材
2.3.1 主要仪器
超净工作台购买自苏州安泰空气技术有限公司；生物安全柜购买自Telstar公司；HERA cell 150二氧化碳培养箱购买自Thermo Fisher Scientific公司；DMI4000B倒置荧光显微镜和D-63505生物光学倒置显微镜购买自Leica公司；THERMO -80℃冰箱购买自Thermo Fisher Scientific公司；可调微量移液器购买自Eppendorf公司；全波长酶标检测仪购买自Thermo Fisher Scientific公司；CFX 96实时PCR检测系统购买自Bio-Rad公司；D1008掌上离心机购买自SCILOGEX公司；数显恒温水浴锅购买自金坛富华公司；303A-3型电热培养箱购买自上海锦屏公司。
2.3.2 实验耗材
细胞培养板、细胞冻存管、细胞培养瓶和离心管购买自Corning公司；枪头、EP管和PCR八连排管购买自Axygen公司；3 mL巴氏吸管购买自Biologix公司。
................................
3 结果与分析 ····················· 20
3.1 PRRSV对MARC-145细胞的TCID50试验结果 ····················· 20
3.2 抗PRRSV活性筛选结果 ····················· 21
4 讨论 ····························· 35
5 结论 ····························· 38
4 讨论
PRRSV可以感染猪的树突状细胞和巨噬细胞，猪肺泡巨噬细胞是其主要靶细胞。PRRSV能与肺泡巨噬细胞上的受体结合进入细胞，通过降低体内干扰素、抗体依赖作用和多糖屏蔽中和表位等机制逃避宿主的免疫清除作用，然后在宿主内进行复制（张明昕，2018）。目前，商业疫苗对PRRSV的防控有限，所以急需开发防治PRRSV的药物。五环三萜类化合物广泛存在于植物中，其中代表化合物如齐墩果酸、熊果酸和甘草酸具有抗病毒活性（刘蒲等，2018），而且已经证实甘草酸在体外具有抗PRRSV的作用（胡安君等，2018）。本论文通过间接免疫荧光试验筛选抗PRRSV化合物，从熊果酸、齐墩果酸及其衍生物等40多个化合物中筛选出在体外具有抗PRRSV活性的化合物。实验过程采用利巴韦林作为阳性药物，因为有文献报道利巴韦林可抑制PRRSV在细胞内的增殖（Khatun et al., 2016）。通过间接免疫荧光实验得到每个化合物抗PRRSV的EC50，发现熊果酸及其衍生物对抗PRRSV的活性比较好。然后建立MTT实验方法评价熊果酸及其衍生物对MARC-145细胞的毒性，算出其CC50，最后得到每个化合物的SI值。挑选出4个SI值大于30的化合物及熊果酸共5个化合物，评价5个化合物是否对不同亚型PRRSV毒株具有广谱的抗病毒作用，分别选用了经典的VR2332、CH-1a毒株及目前兽医临床最流行的NADC30-like毒株，通过间接免疫荧光方法，发现这5个化合物均具有抑制三种毒株增殖的活性，算出每个化合物在每种毒株上的EC50，从而得到每个化合物在每种毒株上的SI值，经比较发现compound-9和compound-12在CH-1a、VR2332、NADC30-like毒株的SI值大于其它化合物。又通过间接免疫荧光方法证明compound-9和compound-12在PAMs细胞上也能抑制PRRSV的复制，所以最终选择compound-9和compound-12做后续研究。
药学论文参考
...........................
5 结论
本文建立了PRRSV感染MARC-145细胞和PAMs细胞模型，从熊果酸、齐墩果酸及它们的衍生物中筛选出具有显著抗PRRSV活性的熊果酸衍生物compound-9和compound-12，初步讨论了两种化合物的抗PRRSV的作用机制，得出以下结论：
（1）Compound-9和compound-12在5～20 µM的浓度范围内以剂量依赖方式抑制PRRSV在MARC-145细胞和PAMs细胞中的增殖，并对不同亚型PRRSV毒株（CH-1a、VR2332、NADC30-like和GD-XH）具有广谱的抗病毒作用。
（2）Compound-9和Compound-12能和PRRSV直接作用，减弱PRRSV的活力，从而阻断PRRSV在细胞上的吸附、内化、复制和释放等多个环节。
本文首次发现compound-9和compound-12在体外具有抗PRRSV的活性，为研发新型抗PRRSV的药物提供了实验依据。本研究后续的工作重点是研究compound-9和compound-12在体内抗PRRSV活性，并阐明其体内和体外的作用机制。
参考文献（略）