本文是一篇药学论文，本研究采用琼脂稀释法测定受试菌株对15种抗菌药物的敏感性，结果显示受试大肠杆菌对氨苄西林、多西环素、氟苯尼考、复方新诺明耐药率都高于80%；对替加环素和阿米卡星较敏感，耐药率都低于10%。
1前言
1.1 NDM酶的概述
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新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM酶），于2009年由英国科学家最早报道，从一名在印度新德里接受过治疗的瑞典患者体内分离的肺炎克雷伯菌中发现，该酶能够水解除氨曲南以外的几乎所有的β-内酰胺类抗生素以及β-内酰胺抑制剂（Yong et al.,2009），在体外药敏实验中，产blaN DM-1的耐药菌仅对黏菌素和替加环素敏感（Walsh et al.,2011）。有学者报道携带blaN DM基因的耐药细菌大多为多重耐药细菌，对大部分β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和大环内酯类等抗菌药耐药。因此NDM阳性菌的出现曾引起了全世界的恐慌，许多学者开始担忧无抗生素可用时代的来临。
NDM酶由270个氨基酸组成，发挥作用的活性中心是金属离子。目前已报道的NDM亚型包括24种，M154L是最常见氨基酸位点突变（10/24），与NDM-1相比，NDM突变体有1～5个氨基酸位点突变，没有一个突变点位于NDM酶活性中心（Wuet al.,2019），但有些位点突变后会使得水解酶活性增强，包括NDM-4、NDM-5、NDM-6、NDM-7、NDM-10、NDM-14、NDM-17、NDM-20和NDM-21，携带blaN DM-5或blaN DM-20细菌对厄他培南MIC比携带blaN DM-1细菌高4～8倍（Hornsey et al.,2011；Liu et al.,2018）。
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1.2 blaN DM流行状况
1.2.1 blaN DM在人医临床中的流行情况
继Yong等（2009）首次报道NDM酶后，其他国家和地区也陆续检测到产NDM酶阳性菌，通过对这些地区病人旅游地和流行病学研究，一些感染blaN DM阳性菌的患者曾到印度、巴基斯坦、孟加拉国和尼泊尔旅游或住院治疗。2011年，法国一家医院从儿童体内分离到一株产bla NDM基因大肠杆菌，一月前该病人曾到印度金奈旅游（Birgy et al.,2011）。有学者在日内瓦大学附属医院从2个病人体内共分离出4株blaN DM阳性菌，1人曾在印度住院治疗（Poirel et al.,2011）。Lotte等（2014）对2名丹麦感染NDM阳性菌的病人调查时发现，有一位病人曾经在印度有住院经历，另一位病人从喀麦隆至法国（Jakobsen et al.,2014），在该地区零星检出CPE可能与国外旅游有关。
2008年～2014年，抗菌药物耐药性趋势监测项目（Study for MonitoringAntimicrobial Resistance Trends，SMART）对来自全球103960株肠杆菌进行碳青霉烯类耐药分析，对厄他培南不敏感肠杆菌有3428株（3.3%），其中1485株（43.3%）肠杆菌产碳青霉烯酶，290株（8.5%）携带blaN DM，包括169株肺炎克雷伯菌、57株大肠杆菌和40株阴沟肠杆菌，从地域分布来看，亚洲地区和南太平洋地区NDM型检出率分别为73.8%（127/172）和51.0%（26/51），其他地区检出率低（Karlowsky et al.,2017）。2010年有学者在金奈、英国、印度和巴基斯坦地区检测出44株blaN DM细菌，仅对替加环素和黏菌素敏感（Kumarasamy et al.,2010）。2014年对印度一家保健中心调查发现，共分离出74株多重耐药革兰氏阴性菌，所有阳性菌对氨曲南耐药，且2株菌对替加环素耐药，共12种不同菌属都表现为blaN DM-1阳性，表明blaN DM-1基因可能通过质粒水平传播方式在不同菌属间传播（Shenoy et al.,2014）。2015年孟买一项临床微生物研究中，110株肠杆菌对碳青霉烯耐药，blaN DM检出率为75.22%（n=85），其中17株和4株肠杆菌分别同时携带blaO XA-48、blaV IM（Kazi et al.,2015）。2011年，首次在肯尼亚住院患者的尿液中检测到携带blaN DM-1的肺炎克雷伯菌，该菌的PFGE谱图与首次报道瑞典产NDM肺炎克雷伯菌相关性高（Poirel et al.,2011）；
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2材料与方法
2.1材料
2.1.1样品来源
2016年～2018年采集自广州市天河区、越秀区、海珠区、白云区、荔湾区、黄埔区和花都区各农贸市场和超市的零售生鸡肉、猪肉和牛肉样品。
2.1.2标准菌株
质控菌：大肠杆菌ATCC®25922，本实验室-80℃保存。
工程菌：大肠杆菌C600和沙门氏菌H9812，本实验室-80℃保存。
2.1.3药物
氨苄西林（ampicilin）北京普博欣生物科技有限公司纯度96.0%
头孢他啶（ceftazidime）中国药品生物制品检定所纯度84.2%
头孢噻肟（cefotaxime）中国药品生物制品检定所纯度89.3%
头孢西丁（cefoxitin）海口市制药厂有限公司纯度98.0%
庆大霉素（gentamicin）中国药品生物制品检定所效价633 U/mg
阿米卡星（amikacin）中国药品生物制品检定所效价655 U/mg
链霉素（strepomycin）上海生工生物工程有限公司效价750 U/mg
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2.2方法
2.2.1细菌的分离鉴定和保存
（1）碳青霉烯类耐药肠杆菌分离：
将各农贸市场和超市样品，加入4 ml已高压灭菌的LB肉汤，37℃，180 r/min震荡培养过夜；用接种环挑取菌液，划线于含1 mg/L亚胺培南麦康凯琼脂板，置于37℃恒温培养箱，培养16～18 h。挑取麦康凯培养基上单菌落纯化和鉴定。
（2）细菌16S rD NA鉴定细菌DNA的制备：
采用水煮法提取细菌DNA。挑取麦康凯上单菌落涂布于含1µg/mL亚胺培南的LB琼脂上，放入培养箱中培养16～18 h，刮取一平环菌加到500µL已高压的1×TE中，用移液器吹打混匀菌体，103℃金属浴12 min，置于冰上冰浴10min，12000 r/min离心5 min，上清液转置于新的灭菌1.5 mL EP管中，4℃保存备用。
引物合成：使用通用引物，合成16S rD NA引物序列：上游引物序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物序列：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'。
目的基因的扩增：根据PCR条件设置反应程序，同时加入阳性对照和空白对照，25μL反应体系如表1，PCR仪运行程序为：
（95℃,5 min）+{（95℃,45 s）)+（55.5℃,45 s）+（72℃,1 min）}×30+（72℃,5 min）
结果判定：将PCR扩增的产物于4℃冰箱保存，配1.0%琼脂糖凝胶（如2.1.7所述），取5μL PCR产物点胶，以DL 2000做参照。PCR扩增阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果提交NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)序列比对。
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3结果与分析··················23
3.1细菌的分离鉴定························23
3.2动物源blaN DM基因检测·······················24
3.3药物敏感性分析·······························26
4讨论·························33
4.1动物源食品CRE污染情况·························33
4.2产NDM酶肠杆菌分子特性······················34
4.3 blaN DM传播载体和基因环境分析···························35
5全文总结···························37
4讨论
4.1动物源食品CRE污染情况
药学论文参考
随着人们的生活水平日益提高，对肉类的需求量日益增加。动物源性食品含有丰富的营养物质，包括蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等，然而这些营养成分除了可以被人体同化，也为微生物生长提供了良好的生存环境，所以动物源食品成为微生物的天然培养基。Qiao等（2017）2007年～2012年从市售肉中分离出96株产ESBL沙门氏菌，其中VIM和KPC的阳性率分别为25.0%（n=24）和10.4%（n=10），这是首次在动物源食品中检测出碳青霉烯酶基因（Qiao et al.,2017）。Wang等（2012）从国内食品动物中分离出1株携带blaN DM-1鲁氏不动杆菌，该菌在食品中普遍存在，且blaN DM-1位于270 kb可接合质粒上（Wang et al.,2012）。Yao等（2016）从市售肉鸡中分离出一株产NDM-9酶阳性大肠杆菌，同时携带fosA3、rmtB、bla CTX-M-65、floR和mcr-1耐药基因，该菌除了对β-内酰胺类药物和黏菌素耐药外，还对磷霉素、环丙沙星等耐药（Yao et al.,2016）。2015年埃及扎加齐格市售鸡肉中blaN DM检出率为11.32%，主要为肺炎克雷伯菌（Abdallah et al.,2015）。水产品中也出现对碳青霉烯类耐药的细菌，Sanjit等2017年分别从鱼类和文蛤样品中分离到一株blaN DM阳性大肠杆菌和一株blaN DM阳性枸橼酸杆菌，2株菌同时携带bla TEM和blaS HV，首次在水产品中检出bla NDM基因（Sanjit et al.,2017）。另有报道从德国市售水产品中分离到1株携带blaV IM-1的ST10大肠杆菌，该菌同时携带bla SHV-12、blaA CC-1和qnrS1等耐药基因，所有耐药基因（除blaA CC-1）都位于IncY型质粒上（Roschanski et al.,2017）。从越南水产品中分离出2株携带blaN DM-1阴沟肠杆菌，NDM基因检出率为0.15%（Roschanskiet al.,2017）。2015年从产地为中国和韩国的海产品中分离到携带bla OXA-48（n=4）细菌，包括嗜麦芽窄食单胞菌、类香味菌、寡养单胞菌和假单胞菌（Morrison et al.,2015）。本研究发现2016年～2018年从广州地区的市售肉品有13.2%的样品检测到CRE，肉源中CRE很可能是通过屠宰加工和运输销售过程中受到污染，赵光辉等（2011）对冷却猪肉分割过程中传送带、工人手、刀具、电锯和案板表面微生物检测，发现随着生产时间延长或与猪肉接触次数越多，猪肉被微生物污染越严重，菌落总数可以达到104/cm2以上（赵光辉，2011）。
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5全文总结
（1）2016年～2018年广州地区市售肉中，CRE携带率较高（13.2%），且逐年增加，碳青霉烯类耐药主要由NDM酶介导，blaN DM-5为主要流行型，对多种抗生素耐药且同时携带多种耐药基因。
（2）CRE主要为大肠杆菌，其次为肺炎克雷伯菌，大部分CRE为非克隆传播关系。
（3）IncX3质粒是bla NDM基因传播的主要载体。
（4）携带blaN DM基因的IncX3型质粒骨架保守，可变区有7种不同的基因环境。
参考文献（略）