本文是一篇药学论文，本论文通过对八角莲植物内生细菌DS3次级代谢产物的初步研究，但距离生产实践还有较大的差距的。对DS3菌株实验条件下的发酵培养基的优化取得了较好的效果，若要进行菌株大批量的发酵，还有待进一步优化DS3菌株的发酵条件。
第一章 绪论
1.1 引言
内生菌生活在植物体内，在植物组织中度过大部分生命周期，且对植物有益[1]。几乎所有的植物中均存在内生微生物[2]。宿主与内生菌一直处于一种内生关系中，寄主植物为内生微生物提供养分，而微生物群落可以增强寄主植物的抗逆性，帮助寄主植物抵抗生物和非生物胁迫[3,4]。内生菌广泛存在于自然界中，是一种重要的微生物资源。目前，内生菌已从苔藓植物、蕨类植物、草本植物和各种木本植物中分离出来[5]。内生菌与寄主植物的相互作用，是植物微生态系统的重要组成[6]。其生长环境的特殊性，因而具有独特的生理和代谢机制。已有研究表明，内生菌与宿主植物共同生长，共享其宝贵的基因，使它们能够产生与宿主植物相似或相同的代谢物质，一些内生菌甚至可以帮助宿主植物合成有效的活性化合物[7,8] 。据报道，内生菌产生的次级代谢产物显示出多种药理活性，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[9]，如紫衫醇、长春碱、鬼臼毒素作为抗肿瘤剂、小檗碱作为抗生素、槲皮素作为抗炎剂、冰片作为抗氧化剂等[10]。
在现代世界，由于微生物耐药性的发展，抗微生物化合物正在失去其优势。面对微生物耐药性（Antimicrobial resitance, AMR），尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）、耐青霉素金黄色葡萄菌（Penicillin-resistant Staphylococcus aureus, PRSA）、耐万古霉素金黄色葡萄杆菌（Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA）和其他耐多药（Multidrug resistance, MDR）菌株引起的感染，因此迫切需要寻找新的抗菌药物[11]。从未开发的天然产物来源中寻找更安全和独特的植物或微生物药物是应对微生物耐药性需求的最佳可能途径[12]。植物内生菌代谢产物多样，能够生产多种生物活性化合物[13]。它们被认为是天然衍生生物活性药物分子的潜在来源[14]。此外，微生物易于分离和生长，且不会对环境和农业生产造成负面影响，是提取生物活性化合物的良好来源[15,16]。从工业和商业上看，扩大微生物的发酵更容易，有利于增加生物制品的产量[17]。同时，它解决了一些天然产物植物生长缓慢和大量开采造成的资源短缺和生态破坏问题[8]。
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1.2 植物内生菌的研究概况
1.2.1 植物内生菌的发展
内生菌与植物之间联系的最早记录是在4.6亿年前，当时从植物茎叶的化石组织中发现了真菌菌丝和孢子[18]。这一发现表明，内生菌和植物的共同进化可能在植物第一次出现在地球上的时候就开始了。所有植物中都存在内生菌，由于植物感染内生菌后症状不明显，其存在和功能一直被忽视。“植物内生菌”的概念最初是在1886被提出，并将其定义为生活在植物组织内部的微生物[19]。Petrini后来将内生菌的定义扩展为居住在植物器官中的微生物群体，在它们生命中的某些时候，可以定殖于植物的内部组织中，且对寄主植物没有明显的伤害[20]。1992年，Kloepper等[21] 提出了“植物内生细菌”的概念。目前，业界普遍认为的植物内生菌是指那些在其部分或全部生活史中存活于植物不同组织和器官中的微生物，且不会对植物本身造成任何感染症状的微生物[22]。
关于植物内生菌的报道最早可追溯到19世纪30年代。1833年，研究人员发现一种未知的锈状物能够在小麦叶片中生长，并命名为Outgrows，多年以后，Leveille等[23,24] 确定该物质为真菌的一种结构，这是关于植物内生菌的首次报道。1876年Paster提取的无菌葡萄果汁，这是最早关于植物内生细菌的研究[25]。1898 年 Vogl从多年生黑麦草（Loliumtum eletum）种子中分离出内生真菌，这是最早对于内生真菌的研究[26]。最早的放线菌是1993年Benson等报道的一株具有固氮能力的弗兰克氏菌属（Frankia）[27]。到20世纪30年代，一起牲畜误食感染内生真菌的牧草而致使牲畜大量死亡的事件，使科学家们开始关注植物内生菌。1993年，Stierle等从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中分离得到一株内生真菌Taxomyces andreanae，研究发现该内生菌能够产生抗癌物质紫杉醇和相关化合物[28,29]，这一发现将植物内生菌的研究推向高潮。此后，越来越多的植物内生菌被分离出来，如红豆杉[30]、喜树[31]、松树[32]等。近年来，随着植物内生菌潜在的农业和医药价值已逐渐成为研究的热点。
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第二章 八角莲内生菌的分离及鉴定
2.1 引言
植物内生菌种类多样，长期生活在植物体内，在与植物共同进化的过程中与宿主植物建立了互惠共存的关系[80]。越来越多的证据表明，内生菌可能参与寄主植物的代谢途径，并获得一些遗传信息，从而产生与其寄主植物相同或相似的天然产物[13,81]。药用植物是活性化合物的重要来源，为制药工业提供各种具有生物活性的天然化合物[82]。从药用植物内生菌中筛选抗菌药物，为丰富药物资源、开发新药解决我国药用植物资源短缺提供了新的途径。
抗生素药物的匮乏迫切需要我们寻找新的抗菌物质，八角莲是我国常见的民间药物，属濒危物种，具有优良的抗菌活性。目前，对八角莲内生菌的报道很少，为了扩大八角莲植物的应用范围，以期从八角莲植物中寻找具有抗菌作用的内生菌。
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2.2 试验材料
2.2.1 主要试验仪器
实验中用到的主要仪器见表2.1。
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第三章 DS3 菌株全基因组测序.............................32
3.1 引言.................................32
3.2 试验方法....................................32
第四章 DS3 菌株发酵条件的优化...............................40
4.1 引言...................................40
4.2 试验材料....................................40
第五章 DS3 菌株抗菌活性物质的分离..............................56
5.1 引言.....................................56
5.2 试验材料...................................56
第五章 DS3菌株抗菌活性物质的分离
5.2 试验材料
5.2.1 试验仪器
验仪器电子天平、培养箱、超净工作台、分析天平和灭菌锅的型号及生产厂家见第二章表2.1；试验仪器低温冷却循环泵的型号和生产厂家见第四章表4.1；其余试验仪器见下表5.1。
药学论文参考
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结论
本论文从八角莲植物的根、茎、叶中共分离到23株内生菌。从分离获得的内生菌中筛选活性菌株。利用第三代测序Nanopore PromethION和第二代测序Illumina NovaSeq6000平台对菌株的全基因组进行测序，anti-SMAS预测DS3的次级代谢产物。采用单因素试验和正交试验对DS3菌株的发酵条件进行优化。随后经过硅胶层析、高效液相色谱、半制备高效液相色谱等分离技术对菌株乙酸乙酯粗提物进行分离纯化，结合质谱及核磁数据解析化合物结构。其主要研究内容如下：
1、 八角莲根部分离得到的内生细菌DS3和DS6能够拮抗金黄色葡萄球菌。其中，内生细菌DS3菌株的抗菌活性优于DS6。对菌株DS3和DS6进行16S rDNA测序分析，将测序结果在NCBI数据库中比对分析，下载相似序列进行系统发育树分析。鉴定DS3菌株为放线菌，DS6菌株为芽孢杆菌。基于DS3菌株广谱的抑菌性，因此选择DS3菌株进行后续的分析。生理生化实验表明，菌株DS3具有产过氧化氢酶、蛋白酶、纤维素酶、分解含硫化合物为硫化氢的能力，不产生脲酶。
2、 利用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq6000测序平台进行DS3全基因组测序分析表明：DS3菌株由一条8,265,668 bp的线形染色体组成，无质粒，GC含量为72.47%；DS3含有6个tRNA，18个rRNA和33个sRNA基因。利用anti-SMASH在线分析DS3的次生代谢生物合成基因簇，该菌株含有31个次生代谢BGCs，包括PKS、NRPS、羊毛硫肽、铁载体和萜烯等；其中有6个合成已知抗生素类的BGCs，以及7个未知类型的BGCs。
参考广场（略）