本文是一篇药学论文，本文建立了一种利用2,4-二硝基氟苯衍生化检测发酵液中L-高丝氨酸含量的HPLC方法。采用Target-phenyl（II）色谱柱，流动相A：水:乙腈:磷酸=95:5:0.01；流动相B：水:乙腈:磷酸=25:75:0.01；检测波长：365 nm；柱温：35℃；流速：1.2 mL/min；进样体积：5.0μL。并对上述液相条件进行了方法学的分析。
引言
1绪论
1.1研究背景
L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸，含有一个手性碳，不仅是合成L-苏氨酸和L-蛋氨酸的前体化合物[1]，还能合成O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、1,3-丙二醇和异丁醇等[2-6]极具价值的化合物。Van Damme及其同事的研究表明，L-高丝氨酸可以诱导免疫反应，从而提高植物的抗病性[7,8]。Bryant KI等人发现L-高丝氨酸能够改善幼雏的生长性能[9]。因此，L-高丝氨酸在制药、农业和化妆品等领域具有广泛的应用。其结构如图1.1所示，理化性质如表1.1。
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1.2生物合成途径
L-高丝氨酸在大肠杆菌中的生物合成途径包括糖酵解途径、三羧酸(TCA)循环和天冬氨酸代谢途径。葡萄糖进入细胞后经过糖酵解途径和三羧酸循环生成L-天冬氨酸[13]，L-天冬氨酸在天冬氨酸代谢途径中经过三个步骤合成L-高丝氨酸。首先，天冬氨酸在天冬氨酸激酶(aspartate kinase，AK)的作用下磷酸化生成天冬氨酸-4-磷酸酯。然后，由asd基因编码的天冬氨酸半醛脱氢酶催化天冬氨酸-4-磷酸酯生成天冬氨酸半醛。最后，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的催化下还原生成L-高丝氨酸[14]。生物合成途径如图1.2所示。L-高丝氨酸在野生型的大肠杆菌培养过程中，不会以中间代谢产物的形式积累，而是作为前体化合物合成L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸等多种氨基酸。
前体化合物的浓度可能是影响L-高丝氨酸生产的一个重要因素。草酰乙酸和L-天冬氨酸是L-高丝氨酸生物合成途径中的两个重要前体物质。草酰乙酸一直被认为是影响L-天冬氨酸家族氨基酸（L-aspartate family amino acids，AFAAs）生产的一个重要因素。已有研究表明，增加合成过程中草酰乙酸的浓度，可以提高L-高丝氨酸的产量[21,22]。通过敲除大肠杆菌中的iclR基因，促进乙醛酸分流可以增加草酰乙酸的含量，进而使下游代谢物L-苏氨酸[23]、富马酸[24]和四氢嘧啶[21]等物质的合成增加。转录调节因子IclR负向调节编码异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的aceBA基因的表达[21]。虽然乙醛酸分支途径在有氧条件下通常不被激活，但转录组结果表明，在L-苏氨酸产生菌中aceBA基因表达显著上调[23]。Liu M等人将iclR基因敲除，发现iclR基因的缺失可以增加L-高丝氨酸的产量，这可能是因为aceBA基因的过表达和草酰乙酸碳通量的增加[20]。
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2 L-高丝氨酸检测方法的建立
2.1材料与方法
2.1.1试剂与仪器
本章所用试剂与仪器详见表2.1及表2.2。
目前氨基酸的检测方法大多是先将样品通过阳离子交换柱分离，然后通过茚三酮试剂进行柱后衍生化，再用氨基酸分析仪对其进行检测分析。上述方法所使用的氨基酸分析仪价格昂贵，操作复杂，应用面较窄。而在高效液相色谱的检测系统中，使用的紫外检测器价格便宜，检测速度快，操作简单，样品稳定。因为上述优势，高效液相色谱法在生物发酵等多个行业逐渐替代氨基酸分析仪[36]。
由于L-高丝氨酸在近紫外区域没有紫外吸收，紫外检测器无法直接测定分析L-高丝氨酸的含量。因此需使用特定化学试剂，对其进行衍生化修饰，通过测定其衍生化后化合物的量，从而间接测定L-高丝氨酸的含量。严雪伟[37]等人，以2,4-二硝基氟苯为衍生试剂，建立了一种检测苏氨酸、亮氨酸等17种氨基酸的高效液相色谱法。该衍生化方法操作简单，衍生物稳定，适用于多种氨基酸的含量测定。
在上述研究基础上，本文通过2,4-二硝基氟苯对L-高丝氨酸柱前衍生化后，再用HPLC进行定量分析。建立一种操作简洁、稳定、分离效果好的检测方法，用于L-高丝氨酸发酵和提取过程的监测。
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2.2结果分析
2.2.1色谱柱优化
样品经过4根不同色谱柱进样分析后，当色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18、AgilentZORBAX SB-C18和ChromstarT M NH2，L-高丝氨酸衍生物的吸收峰都与衍生化试剂产生的相邻杂质峰部分重叠，不能用于L-高丝氨酸的检测。当色谱柱为Target-phenyl（II）时，L-高丝氨酸衍生物的吸收峰都与衍生化试剂产生的相邻杂质峰分离度大于1.5，不干扰检测，理论踏板数高于5000，满足HPLC基本检测要求。因此选择Target-phenyl（II）色谱柱，进行L-高丝氨酸的分析检测。
2.2.2专属性实验
专属性实验结果如表2.4所示。L-高丝氨酸衍生物的吸收峰与相邻杂质峰分离度大于1.5，不干扰检测，满足HPLC基本检测要求。故该方法适用于L-高丝氨酸的分析检测。
纯水衍生化后，液相图谱上8.9 min附近没有出现吸收峰，L-高丝氨酸对照品衍生化后，液相图谱上8.959min处出现吸收峰，与A图相比，B图8.959 min处有吸收峰，因此该峰为L-高丝氨酸衍生物的吸收峰。发酵液衍生化后，在8.953 min处出现紫外吸收峰，与B图出峰时间基本相同，故该吸收峰为L-高丝氨酸。因此该液相条件能够用来检测发酵液中的L-高丝氨酸。
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3 L-高丝氨酸发酵条件的优化................................16
3.1 材料与方法...........................16
3.1.1 菌种..........................................16
3.1.2 培养基.......................................16
3.1.3 试剂与仪器..................................16
4 发酵罐分批补料实验................................37
4.1 材料与方法...................................37
4.1.1 菌种.......................................37
4.1.2 培养基..............................................37
结论.........................42
4发酵罐分批补料实验
4.1材料与方法
4.1.1菌种菌株：大肠杆菌SIIA-2021-13（Escherichia coli SIIA-2021-13）由成都大学药学院微生物药物实验室保藏并提供。
4.1.2培养基
固体培养基（平板、斜面）、种子培养基配制方法参考3.1.2节。发酵培养基（g/L）：葡萄糖26.05，酵母浸粉1.2，亮氨酸4.8，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.8，(NH4)2SO4 14.0，L-赖氨酸0.5，L-苏氨酸0.5，微量元素母液5.0 mL/L，使用4M NaO H调最终pH至7.0；
补料培养基（g/L）：亮氨酸0.96，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 0.2，L-赖氨酸0.5，L-苏氨酸0.5，微量元素母液5.0 mL/L。葡萄糖补料浓度：600 g/L。
4.1.3试剂与仪器
本章所用部分试剂与仪器见表4.1和表4.2。
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结论
本研究主要结论：
（1）本文建立了一种利用2,4-二硝基氟苯衍生化检测发酵液中L-高丝氨酸含量的HPLC方法。采用Target-phenyl（II）色谱柱，流动相A：水:乙腈:磷酸=95:5:0.01；流动相B：水:乙腈:磷酸=25:75:0.01；检测波长：365 nm；柱温：35℃；流速：1.2 mL/min；进样体积：5.0μL。并对上述液相条件进行了方法学的分析。结果表明，该方法重复性RSD值为1.39%，精密度RSD值为0.12%，9个组加样回收率均在90%-110%之间。L-高丝氨酸质量浓度与峰面积在50~350µg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为：Y=7.8662X+31.779（R2=0.9995）。综上所述，本文建立的方法对于L-高丝氨酸的分析，具有较高的重复性，精密度和良好的线性关系，并且该方法具有操作简洁，稳定，分离效果好等优点，可以用于L-高丝氨酸发酵和提取过程的监测。
（2）以E.coli SIIA-2021为出发菌株，通过自然分离得到优良菌株E.coliSIIA-2021-13。初步确定了最佳发酵条件：最适初始pH值为7.5，最适接种量为2%，最适种子液OD600为0.6~0.8；初步确定最适培养基成分（g/L）：葡萄糖26.05，酵母浸粉1.2，亮氨酸4.8，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.8，(NH4)2SO4 14.0，L-赖氨酸0.2，L-苏氨酸0.2，CaCO3 10.0，微量元素母液5.0 mL/L；菌株E.coli SIIA-2021-13在上述发酵条件以及培养基成分下，在摇瓶中发酵培养，发酵液中L-高丝氨酸的产量能达到7759.47μg/mL，比优化前的3165.35μg/mL提高了145.14%。
（3）在50 L发酵罐上对摇瓶最适发酵条件以及最适发酵培养基成分进行验证实验，结果显示L-高丝氨酸的发酵产量达40442μg/mL。并初步探讨了不同补料方式对L-高丝氨酸产量的影响，结果显示三次补料方式，L-高丝氨酸产量最高，达到55932μg/mL，比优化前提高了38.3%。
参考文献（略）