本文是一篇药学论文，本研究构建米哚妥林合成中间体星形孢菌素的高产工程菌，建立了其发酵和纯化工艺，为产业化奠定了基础。
第1章绪论
1.1星形孢菌素研究概况
1.1.1星形孢菌素的基本结构
星形孢菌素（Staurosporine，STA）最初于1977年从细菌StreptomycesStaurosporeus AM-2282分离得到的一种生物碱[1]。1994年，通过单晶的X射线分析和绝对立体化学构型，阐明了星形孢菌素的化学结构[2]，它由吲哚咔唑核心和氨基己糖构成[3]。
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1.2立题依据
2017年4月，美国FDA批准米哚妥林被用于治疗新诊断的急性髓细胞白血病（AML），米哚妥林是一种抗肿瘤药物。2022年全球米哚妥林市场销售额约24亿元。
本实验室前期对星形孢菌素产生菌进行自然分离纯化筛选和摇瓶发酵，经过初步研究得到了一株性状相对稳定的Streptomyces sp ST-23(本实验室保藏)作为出发菌株，建立了星形孢菌素的HPLC分析方法。但由于初始的产星形孢菌素菌株发酵单位较低，星形孢菌素提取收率和纯度偏低，无法满足工业化生产的需求。因此本研究从多方面入手，结合诱变筛选、对培养基和培养条件优化及发酵罐工艺条件优化等方法，来获得STA产量较高的出发菌株和适宜的发酵条件。再采用基因工程的手段对高产菌株进行定向改造，进一步提高STA的产量，建立一种成本低、步骤简单、易于放大生产和收率较高的STA提取工艺，为STA的放大生产奠定基础。
研究内容如下：
1、星形孢菌素产生菌的诱变选育；2、SIPI-ST-07电转化条件优化及其工程菌构建；3、SIPI-ST-07摇瓶发酵工艺优化；4、SIPI-ST-H-23发酵罐发酵工艺优化；5、星形孢菌素分离纯化工艺优化；
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第2章星形孢菌素产生菌的诱变育种
2.1实验材料
2.1.1菌株
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2.1.4培养基与溶液的配制
1）培养基
斜面培养基（%）ISP2：葡萄糖0.4，麦芽浸粉1，琼脂1.8，酵母提取物0.4，pH 7.0。
PDA培养基（%）：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂1.8，pH 7.0。
种子培养基（%）：酵母粉0.5，葡萄糖2，碳酸钙0.2，玉米淀粉0.5，玉米浆干粉0.5，大豆蛋白胨0.5，pH 7.0。
发酵摇瓶培养基（%）：葡萄糖4，玉米淀粉1，棉籽饼粉1.7，黄豆饼粉1.5，酵母粉0.5，磷酸二氢铵0.1，五水硫酸亚铁0.05，碳酸钙0.4，五水硫酸铜0.1，硫酸镁0.1，pH 6.3。
*以上培养基均需121℃灭菌20 min。
2）星形孢菌素标准品的配制
精密称量（星孢菌素）25 mg，装于25 mL容量瓶，加甲醇至25 mL刻度，溶解，混匀；过滤0.22μm滤膜，上清液HPLC分析。
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2.2实验方法
2.2.1培养方法
1）平板培养：
从冰箱中取出STA产生菌的甘油管，待甘油融化后，取30μL菌液均匀的涂布在ISP2培养基上进行活化培养，在28℃培养箱中培养6~7 d，待平板表面上出现大量淡黄色的孢子即可。
2）种子培养：
（1）一级种子培养
用无菌铲刮取1 cm×1 cm大小的孢子到种子瓶，使用250 mL三角摇瓶，摇瓶装量30 mL、28℃、250 rpm摇床培养2 d。
（2）二级种子培养
摇瓶装量100/750 mL，二级种子接种量为5%，28℃、250 rpm摇床培养1 d。
3）发酵培养：
摇瓶装量30/250 mL，一级种子接种量为10%，28℃、250 rpm摇床培养5 d。
2.2.2菌丝体制备
在培养好的ISP2平板培养基中刮取大量的SIPI-ST-23的菌丝体，将刮取的菌丝体放入提前准备好带有玻璃珠的试管中，在试管中加入一定量的无菌纯化水，将其混合均匀，一定需要把SIPI-ST-23的菌丝体充分打散均匀，把菌丝体进行过滤，把过滤的滤液用20%甘油溶液洗涤3次，离心后丢弃上清液，再将菌丝体用30%甘油溶液重新进行悬浮，对菌丝体悬浮液进行分装，保存在-70℃冰箱中备用。取上述制备好的菌丝体进行梯度稀释涂布，培养7天之后计算其菌丝体的数量，保证保存的菌丝体浓度在105个mL左右。
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第3章 SIPI-ST-07电转化条件的优化及其工程菌构建 ..................... 17
3.1 实验材料 .............................. 17
3.1.1 菌株 ..................................... 17
3.1.2 实验试剂盒 ............................ 17
第4章 SIPI-ST-07的摇瓶发酵工艺优化 ..................... 39
4.1 实验材料 ............................. 39
4.1.1 菌株 ....................................... 39
4.1.2 实验试剂 ........................................ 39
第5章 SIPI-ST-H-23发酵罐发酵工艺优化 .......................... 65
5.1 实验材料 ................................... 65
5.1.1 菌株 .................................... 65
5.1.2 实验试剂 .............................. 65
第6章星形孢菌素分离纯化工艺优化
6.3实验结果
6.3.1星形孢菌素发酵液预处理的影响
6.3.1.1酸碱处理对星形孢菌素发酵液预处理的影响
将发酵好的发酵液进行调不同的pH，搅拌1h，HPLC检测单位，结果如下；
药学论文参考
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全文总结
（1）首先，以星形孢菌素产生菌SIPI-ST-23为出发菌株，通过自然分离、UV、NTG诱变及抗性筛选，确定SIPI-ST-23菌株的最佳紫外诱变时间为90 s，最佳的NTG处理时间为90 min，最大耐受星形孢菌素浓度为150 mg/L，链霉素的最小抑制浓度为50 mg/L，色氨酸和甲硫氨酸的最小抑制浓度分别为0.2%和0.4%。经过多轮诱变筛选，从1277株突变株中获得了一株高产突变菌株，被命名为SIPI-ST-07，该菌株的发酵单位为503 mg/L，在ISP2平板上营养菌丝颜色为黄色，菌落形态较大；显微镜镜检发现，其菌丝体细长且密集，孢子为圆形，一级轮生。
（2）其次，对星形孢菌素产生菌SIPI-ST-07进行电转化条件的优化及其基因工程菌的构建，以SIPI-ST-07菌株为出发菌株，对电转化条件进行优化，获得了最佳的电转化条件：甘油/甘露醇浓度比20:1.5、甘氨酸浓度2%、电场强度9 kV/cm、SIPI-ST-07菌丝体浓度150L、质粒浓度1g、孵化时间6 h以及温度0~4℃，电转化效率从最初的4×106提高到9.6×108 CFU/g DNA。采用PCR扩增的方法获得相应的基因片段，通过同源重组构建重组质粒，筛选获得重组子和高产菌株。结果表明，获得了pIB139-vgb、pIB139-fkbN、pSET152-staR、pSET152-staR-ermE*p、pSET152-staR-kasO*p五种重组质粒，成功构建了SIPI-ST-A-1（pSET152）、SIPI-ST-B-17（pIB139-vgb）、SIPI-ST-C-6（pIB139-fkbN）、SIPI-ST-D-5（pSET152-staR）、SIPI-ST-E-9（pSET152-staR-ermE*p）和SIPI-ST-H-23（pSET152-staR-kasO*p）等六种工程菌。
参考文献（略）