本文是一篇药学论文，本实验采用IL-1β处理MH7A细胞以模拟体内滑膜成纤维细胞的异常增殖及细胞迁移、侵袭、活性氧产生等病理条件，以评估天然产物抗RA滑膜增生的作用。MAG在“治痹要药”威灵仙中的含量高达0.1%，也是威灵仙传统水煎入药的化学成分，然而其是否具有抗RA滑膜增生作用还未见现代药理研究报道。
1 绪论
1.1 木兰花碱研究现状
1.1.1 木兰花碱概述
生物碱是植物药中含有的一类重要的天然产物，具有较为突出的生物活性。木兰花碱（Magnoflorine, MAG），又称唐松草碱，玉兰碱，洋玉兰碱，是一种经典的阿朴菲型生物碱。分子式为C20H24NO4+，分子量为342.41 g/mol，结构式如图1.1所示。MAG的1, 11位处分别有1个-OH， 2, 10位处分别有1个-OCH3，6位处有2个-CH3。因此，它也得名为(6aS)-1,11-dihydroxy-2,10-dimethoxy-6,6-dimethyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolinium （IUPAC命名）。MAG为季铵盐类生物碱，通常溶于水、乙醇，不溶于石油醚等低极性有机溶剂[1]。
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MAG是阿朴菲型生物碱，存在于许多开花植物科中，如毛茛科、防己科、木兰科。现代研究表明，MAG能从常用的植物药中提取分离得到，包括风龙（Sinomenium acutum (Thunb.) Rehder & E.H.Wilson）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）、甘肃小檗（Berberis kansuensis C.K.Schneid）等[1]。此外，MAG还能从威灵仙（Clematidis Radix et Rhizoma）中分离获取。威灵仙来源于毛茛科铁线莲属植物威灵仙（Clematis chinensis Osbeck）、棉团铁线莲（Clematis hexapetala Pall.）或东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr.）的干燥根和根茎，而MAG主要是从威灵仙基源之一，即东北铁线莲的干燥根和根茎中分离得到[2]。此外，威灵仙具有较好的祛风湿、通经络、止疼痛之效，也是祛风除湿类中成药的主要药味。
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1.2 类风湿性关节炎研究现状
1.2.1 类风湿性关节炎概述
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种较为常见的自身免疫性疾病，它会引发关节的剧烈疼痛、肿胀、僵硬，进而影响患者的正常活动，甚至会影响其日常生活质量[31]。统计数据显示，全球约有0.5-1.0%的人口患有RA，其中约三分之一的人可能在20年内致残。因此，若未及时治疗RA，它将逐渐恶化，最终造成患者的严重残疾并增加社会经济负担[32-33]。RA的发病机制非常复杂，除了与个体遗传因素、环境因素和免疫失调有关外，在病理机制上主要涉及到滑膜增生、关节和软骨损伤。其中，滑膜增生将会引起滑膜成纤维细胞恶性增殖、迁移、侵袭与黏附，导致炎症反应加重与缺氧环境，进而激活RA相关信号通路，在RA发病过程中占据着非常重要的作用。目前用于治疗RA的药物主要包括：非甾体类抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质类激素、生物制剂等。然而糖皮质类激素、非甾体抗炎药对缓解僵硬和疼痛有效，却不能阻滞疾病的加重；改善病情抗风湿药能有效减轻关节肿胀、疼痛、畸形，但其抑制关节破坏的能力非常有限。此外，这些药物常伴有心血管并发症、胃肠道病变、生殖疾病等不良反应，生物制剂具有较好的疗效，但其费用十分昂贵，在一定程度上限制其使用。因此，开发更加安全有效、毒副作用小的抗RA药物迫在眉睫。
1.2.2 类风湿性关节炎的发病原因
RA的发病机制十分复杂，尚未完全阐明，但目前普遍认可的是：遗传因素和环境因素是RA发病的重要原因。研究表明，患RA的风险约有一半来自于遗传因素，结构变异标记的遗传区域鉴定结果表明超过30个基因区域与RA有关。然而，目前的研究仅发现与自身免疫疾病高度相关的PTPN22、HLA基因突变会引起RA，却未建立其余基因与RA发病的遗传关联[34-35]。值得关注的是，2 mm DNA出现在这30个候选变异的DNA中，对其进行测序研究很可能会为RA的发病机制提供新的思路。另外，RA在男性、女性的发病率存在差异，且女性中的发病率是男性的三倍，患病率随着年龄的增长而上升，在65岁以上的妇女中最高，这表明激素可能是RA发病及影响其发病发生频率的重要因素[36]。外界环境因素（如生活习惯、饮食）与RA发病有着紧密联系，高蛋白饮食会提高患RA的潜在风险，而多摄入蔬菜水果将降低患病风险。吸烟作为最主要的影响RA患病因素，能通过影响机体自身抗体形成、炎症反应引起并加剧RA[37]。
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2 木兰花碱对佐剂型关节炎大鼠的抗类风湿性关节炎作用
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验动物
SPF级5周龄、雄性Wistar大鼠，体重为120 ± 20 g，从成都达硕实验动物有限公司购买，所购买大鼠的生产许可证号为SCXK, 2020-030。实验方案按照成都大学动物保护与使用专业委员会批准的指导原则进行，实验动物批准号为2018-35。实验动物的饲养环境和方法完全符合《中华人民共和国实验动物管理条例》规定。
2.1.2 实验主要试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 动物分组、造模及给药
适应性饲养40只Wistar大鼠一周，以每组8只进行随机分配：对照组（Control group）、模型组（AIA group）、MAG高剂量组（MAG 10 mg/kg）、MAG低剂量组（MAG 5 mg/kg）、甲氨蝶呤阳性药组（methotrexate, MTX 1 mg/kg）。
根据文献报道的方法[62]，采用1.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，向除对照组外的其余4组大鼠右后爪足跖皮下部位注射0.1 mL CFA，而向对照组大鼠的右相同部位注射0.1 mL生理盐水，用棉签轻轻按压注射部位，记为第0天。造模后第14天开始，向MAG高剂量组、MAG低剂量组大鼠腹腔注射不同浓度的MAG，每天一次；向甲氨蝶呤阳性药组大鼠腹腔注射1 mg/kg MTX，一周三次。对照组和模型组大鼠接受腹腔注射等体积的0.9%生理盐水，给药时间共22天。具体的试验方案见图2.1。
2.2.2 大鼠体重
造模前一天记录老鼠体重，造模后第4，8，12，16，20，24，28，32，35天的同一时间对各组大鼠体重进行称重并记录。
2.2.3 大鼠足肿胀度
采用足跖容积测定仪对各组大鼠的足肿胀进行测定并记录，在每只大鼠右踝关节固定位置做标记，将大鼠踝关节拉直，放入足跖容积测定仪中，使标记与水面平齐，记录仪器读数。造模后第4，8，12，16，20，24，28，32，35天的同一时间对各组大鼠的足肿胀度进行记录。
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3 木兰花碱对 IL-1β 诱导的 MH7A 细胞的抗类风湿性关节炎滑膜增生作用及其机制研究.....................23
3.1 实验材料与仪器...............................23
3.1.1 实验主要试剂.............................23
3.1.2 实验仪器...................................24
4 结论...............................61
4.1 全文总结......................................61
4.2 不足与展望.............................62
3 木兰花碱对IL-1β诱导的MH7A细胞的抗类风湿性关节炎滑膜增生作用及其机制研究
3.1 实验材料与仪器
3.1.1 实验主要试剂
药学论文参考
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4 结论
4.1 全文总结
RA是一种长期的自身免疫性疾病，又称“不死的的癌症”，严重影响人们的日常生活。虽然RA的确切发病机制尚不清晰，但基因遗传因素及环境因素是引起RA的重要原因。此外，RA疾病的发生发展过程中往往伴有炎症、滑膜细胞浸润、免疫功能障碍和软骨损伤，而滑膜成纤维细胞的异常增殖是引起RA最直接的病理表现。因此，本实验采用IL-1β处理MH7A细胞以模拟体内滑膜成纤维细胞的异常增殖及细胞迁移、侵袭、活性氧产生等病理条件，以评估天然产物抗RA滑膜增生的作用。MAG在“治痹要药”威灵仙中的含量高达0.1%，也是威灵仙传统水煎入药的化学成分，然而其是否具有抗RA滑膜增生作用还未见现代药理研究报道。基于此，本研究建立了IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞MH7A模型、CFA诱导的AIA大鼠模型以评估MAG的抗RA滑膜增生作用及其作用机制，得出以下结论：
（1） 体内动物研究：
① MAG能缓解CFA所引起的大鼠体重减少、足肿胀度、关节炎评分；
② HE染色结果表明，MAG明显缓解了AIA大鼠踝关节滑膜组织中滑膜细胞侵袭、炎症细胞浸润、上皮细胞降解，进而减轻其踝关节组织病理状态；
③ ELISA实验发现MAG下调大鼠血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α，上调抗炎因子IL-10；以上结果表明MAG在体内具有良好的抗RA滑膜增生作用。
（2）体外表型研究：
① 对于IL-1β诱导的MH7A细胞内炎症反应，MAG通过抑制IL-6、IL-8、COX-2、iNOS mRNA和蛋白水平减轻炎症风暴；
② 对于IL-1β诱导的MH7A细胞内氧化应激，MAG抑制ROS产生；
③ 对于IL-1β处理的MH7A细胞迁移、侵袭、细胞凋亡与细胞周期变化，MAG下调MMPs表达，上调Bax、下调Bcl-2，从而抑制MH7A细胞迁移与侵袭，促进细胞凋亡，并诱导MH7A细胞阻滞于G0/G1期。
参考文献（略）