绪论
1.1近等基因系
1.1.1近等基因系的概念
近等基因系（neai_-isogenic line. NIL )是指除了目标基因附近的基因组存在差异外，其他部分的遗传物质大致相同的两个遗传材料。一般是经过饱和回交形成目标性状有差异，其他遗传背景完全相同。理论上近等基因系排除遗传背景的影响，避免基因间互作，使单个基因的效应得以充分表露，因而在作物遗传育种、生理生化、目标基因或位点的定位克隆、基因功能分析等方面广泛应用。近等基因系的构建主要有以下三个途径：一是回交，通过回交把需要的特定性状的等位基因转移到另外一个具有相同遗传背景的品种上，一般回交5代以上，目前大豆近等基因系的构建主要采用这种方法；二是通过突变选择产生，通过人工诱变的手段，使原始亲本的基因组发生突变，从原来群体中分离山来形成近等基因系；二是分子标记辅助选择的回交选育法，通常是回交几代以后，在分子水平上利用与目标性状连锁的分子标记进行蹄选，排除人为因素、环境因素可能造成的偏差，保证近等基因系的真实性(常汝镇1991;段红梅2002)。
1.1.2近等基因系的研究进展
在作物育种中不可避免地残存有除抗病基因以外的其他基因，有些基因可能对作物的产量、品质性状产生不利影响。近等基因系材料的两个材料的遗传背景一致，只保留了我们需要的基因，所以可以锁定目标基因、去除连锁累赘，是育种、研究植物生理生化和分子牛.物学的理想材料。张文英等(2012)利用分离群体对抽薹性状等进行表型鉴定和分子标记辅助选择，初步构建了2个早抽薹近等基因系(BC6F4；)，并对其农艺性状和生理指标进行鉴定，结果表明，构建的两个近等基因系的早抽薹性状表现整齐，分别比轮回亲本抽薹时间提早42 d和45d。段爽等(2012)利用具的小麦-簇毛麦染色体易位系6AL/6VS为抗病供体，与对白粉病敏感的优良小麦栽培品种京411为轮回亲本杂交、F1个体回交7次，培育了近等基因系，并用蛋白质组学的方法检测NIL的选择效率。章请等(2002)以籼稻品种JG30作为轮回亲本，与携带有^^23的供体亲本H4杂交，通过人工接种和分子标记辅助选择构建;化2_?的近等基因系CBB23。沈圣泉等(2005)用轮回亲本密阳46的5/基因抗螺虫近等基因系，研究了价基因对水稻相关性状的影响。结果表明，价基因对纯系植株的前期生长有一定的抑制作用。国际水稻研究所用籼稻品种C090为轮回亲本育成一套由4个系统组成的近等基因系(刘秉华等，1994; Mew,王久林等，2000;高乾坤等，2009)。目前国际上用于病原菌生理小种研究的近等基因系主要有2套：中国培育的近等基因系和国际水稻研究所育成的近等基因系。中国培育的近等基因系以普感品种丽江新团黑谷(LTH)为遗传背景，该品种是稻瘟病生理小种的普感品种，对籼、粳稻区的菌株都有高度的生理小种鉴定能力。RRI培育的近等基因系的轮回亲本为C090，对曰本菌株54-04、研53-33、北1、P-2b和中国北方稻区的菌株Zh2-1、91-17、91-18、91-65-1、98-89-1和91-86-2等，表现高抗和中抗反应，不适合在国际上作为稻痕病生理小种的鉴别体系。
1.2稻瘟病的危害及浸染机制
V稻癌病足世界范围内水稻最严重的病害之一，和白叶枯病、纹枯病被称为水稻三大病害。它具有易暴发成灾的特点，一般可引起水稻减产10?20%,严重时能造成水稻绝收。近年来局部地区的大流行仍频繁发生(朱永生，2007)。稻癌病通过气流传播，主要侵染植物的叶片、穗部和莲杆，根据稻癌病不同的发病时期又分为苗瘟、叶瘟、穗莲癌等。苗癌主要发生于三叶前，由种子带菌所致。病苗基部灰黑，上部变褐，卷缩而死，湿度较大时病部产生大量灰黑色霉层，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。叶瘤在水稻整个生育期都可能发生。分蘖至拔节期为害较重。稻瘟病难以防治的主要原因在于人们对稻癌病和水稻之间的互作关系仍缺乏深刻的了解。稻瘟病菌是丝状子囊菌，对水稻品种的致病性有专一性，可以划分为不同的生理小种。稻瘟病菌在世代生长和侵染机制方面有独特的特点，稻痕病菌侵染水稻的致病过程可以分为以下儿个阶段：（1)在特定的环境条件下孢子萌发，孢子尖端会分泌类似點胶的物质，附着在水稻叶片的表面；（2)在湿度适宜时，成熟分生孢子顶胞或基胞会生成成芽管，进而在2-4h分化成附着胞，特异性吸附在水稻叶片的角质层上；（3)附着胞形成侵染栓并分泌产生一些酶类物质，通过菌体细胞质黑色素增加形成的膨压穿透水稻表皮和细胞壁；（4)侵染栓在叶片的表皮细胞中分化成丛生次生菌丝并侵入邻近的叶肉细胞；(5) 5?7d后新的分生孢子成熟并产生新的孢子细胞，从水稻叶片的病斑处释放出来，病害进入下一轮周期。
第二章稻瘟病抗性近等基因系的鉴定
前言
稻瘟病是全世界水稻最严重的病害之一、常规的控制病害的方式是化学防治和种植抗病品种的方法。由于化学防治会造成环境的污染，化学药品的残留也会对人体的健康产生不利的影响；另一方面，由于稻癌病生理小种快速变异，种植的抗病新品种推广后几年后就会丧失抗性。随着分子生物学的飞速发展，国内夕卜的科学家对于病原菌运用分子标记定位和克隆了部分无毒基因；在水稻中，也定位了一系列的抗病基因；除此之外，在分子水平上关于病原菌生理小种与寄主的抗性基因互作的机理也做了深入的研究。近等基因系在水稻的育种每践中得到了广泛的运用，主要是选育多系品种。特别是对于病原菌生理小种变异快、类型多的病害，将多个抗性基因导入到产量、品质较佳的同一品种，获得的近等基因系遗传背景一致并带有多个抗病基因，然后根据实际情况按比例混合种植，能很好的提高高产、优质品种的抗性持久性，发挥品种的生产潜力。本研究材料梗稻云引对大多数的稻癌病菌表现抗性，本实验室前期对该材料的抗病基因的挖掘、抗病机理和调控途径进行了深入的研究。与感病材料丽江新团黑谷杂交获得近等基因系，剔除遗传背景干扰对云引材料抗性基因精细定位和功能研究具有重要的意义。
第三章稻瘟病抗性近等基因系材料.......... 25
第一节材料和方法.......... 25
3.1.1试验材料 ..........25
3.1.2实验方法.......... 25
第二节结果与分析.......... 31
3.2.1近等基因系抗、感病材料叶片.......... 31
3.2.2差异表达蛋白点的质谱鉴定.......... 33
第三节讨论 ..........38
第四章候选蛋白的荧光定量.......... 41
第一节材料与试剂 ..........41
4.1.1生物材料 .......... 41
4.1.2主耍试剂.......... 41
4.1.3主耍仪器.......... 42
第二节实验方法.......... 42
第三节结果与分析.......... 46
结论
根据上一章对谷脱甘肽转移酶、氧化酶功能的分析，它们在植物机体防御和修复过氧化损伤发挥着重要作用。编码碟脂酶D的基因(图b)在水稻的正常生理过程中都保持着高表达量。结果显示在水稻抵御病原菌侵害的关键阶段12h-48h却出现了下调表达，推测是磷脂酶D的活性降低，可以将减缓植物体的生理生化反应，降低植物新陈代谢速度，保持体内能量来抵御外界的生物胁迫。编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白的基因(图e)的表达量在水稻受到病原菌侵害的过程中逐步的上调表达，之后下调表达，接菌后96h，该基因的表达量恢复到Oh的水平。表明参与信号转导的蛋白质鸟噪呤核苷酸结合蛋白在抵御外界侵害的过程中发挥着重要作用。
当植物处于不利的环境中，植物信号转导相关的酶特异的上调表达，可以让植物机体及时的接收到信号，做出适当的反应，维持植物正常的生长发育。本研究初步分析了获得的差异蛋白质的相关功能和生理特性，为进一步探索水稻的抗病机理提供了有力依据。根据这些准确的蛋白质序列信息推断相应的基因序列，从而为定位、克隆这些功能基因提供有效的依据。后续试验的展望：本研究停留在分析差异蛋白质的功能上，在后续实验中希望将抗病相关蛋白质之间的互作，在抗病过程执行的不同功能进行分析，构建抗病反应的网络图谱。找到病原菌侵染途径中的关键酶，为水稻抗病性的研究找到一个新的方向。实验过程中的不足之处：在焚光定量PCR的实验过程中，出现误差较大、重复性不好的现象。除个人实验操作要更加规范以外，模板浓度低、移液枪加入试剂的准确性也至关重要。
参考文献
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