前言
前庭毛细胞损伤所导致的平衡功能障碍是临床上的常见病、多发病。造成前庭毛细胞损伤的致病因素多种多样，最常见的原因包括使用氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物和罹患梅尼埃病等各类内耳疾病。目前对前庭功能障碍的治疗措施主要是康复锻炼和对症治疗等保守手段，临床医生常使用各类药物来减缓前庭功能障碍所导致的弦晕、呕吐等不适症状。但这类治疗措施难以从根本上治愈毛细胞损伤所导致的前庭功能障碍。相关基础研究表明，哺乳动物的毛细胞在损伤后可以部分再生，但再生的毛细胞数量十分有限，难以带来前庭功能的根本改善[1-3]。基因治疗是具有广阔发展前景的能够有效促进毛细胞再生的潜在治疗手段。颞骨病理学研究表明，即使在受到严重损伤的情况下，人内耳感觉上皮内仍然残留有大量支持细胞和部分毛细胞[4]。因此通过基因治疗的方法诱导受损前庭上皮内的支持细胞转化为毛细胞将是恢复毛细胞数量的可行手段。基因Atohl/Mathl是bHLH转录因子家族中的一员，其在多种动物组织的发育过程中起着重要作用。在哺乳动物体内，作为果幡atonal基因的同源基因，Atohl/Mathl最早被发现表达于神经系统中[5]。atonal和Atohl/Mathl两者编码序列相近，功能上也有相似之处。事实上，atonal可以完全替代Atohl/Mathl在哺乳动物体内发挥作用[6]。在哺乳动物发育过程中，Atohl/Mathl能够诱导包括小脑颗粒细胞(Cerebellargranule cell)、小脑菱状唇中间神经元（cerebellar rhombic lip interneuron)、背侧交叉神经元（dorsal commissural interneuron)、小肠杯状细胞（gobletcell of intestine)、皮肤 Merkel 触觉感受细胞(Merkel touch-sensitive cellin skin)和内耳毛细胞等许多特殊种类细胞的发育[7]。虽然相关研究普遍认为Atohl/Mathl主要对许多特殊类型细胞的终末分化有重要促进作用，但也有证据表明Atohl/Mathl也可表达于特定的前体细胞群[8]，并且Atohl/Mathl基因的表达与大脑成神经管细胞瘤（medulloblastoma)的发展有密切的相关性[9-11],这表明在某些情况下，Atohl/Mathl具有维持前体细胞状态并促进其增殖的重要作用。
以往研究表明Atohl/Mathl在动物组织发育中的作用似乎可分为两个不同的阶段。在果姆复眼发育过程中，atonal首先表达于整个前神经区（theproneural field)的所有细胞，随后在Notch信号通路的介导的侧向抑制作用下特异性的表达于其中的一部分细胞并促进这些细胞分化为一种特殊类型的光感受器[12, 13]。与此类似在鸡内耳上皮的损伤后再生过程中，Atohl/Mathl首先广泛表达于整个上皮内的所有细胞，随后局限于一部分细胞并使其分化为毛细胞[14]。在斑马鱼体内存在着Atohl/Mathl的两种同源基因atohla和atohlb，这两个基因功能类似，均能确定前神经区并促进感觉细胞发育，但atohla的作用侧重于确定前神经区，而atohlb的功能主要为促进感觉细胞发育[15]。在小鼠的内耳发育过程中，Atohl/Mathl的作用似乎仅局限于促进毛细胞发育。虽然编码Atohl/Mathl的mRNA在前感觉区（the precursor domain)形成前便可检测到[16，17],但Atohl/Mathl蛋白仅存在于有丝分裂后向毛细胞方向分化的前体细胞[18]。并且基因敲除实验表明，Atohl/Mathl对前感觉区形成和前体细胞退出有丝分裂并无关键的调节作用[16，18，19]。
除了转录因子Atohl/Mathl以外，目前已知Notch信号通路，FGF信号通路和BMP信号通路对内耳毛细胞的发育也有重要调节作用。Notch通路在内耳感觉上皮发育早期有确定前感觉区的重要作用，在胚胎发育早期干扰Notch信号通路可以导致毛细胞增多和支持细胞减少[20-22]。在刚出生后不久和成年的小鼠椭圆囊感受上皮中去除毛细胞或使用措抗剂抑制Notch信号通路，能够过上调Atohl/Mathl的表达水平并使部分支持细胞转化为毛细胞[23，24]。目前有关FGF和BMP信号通路的研究主要集中在耳锅Corti氏器。FGF8表达与耳锅Corti氏器内毛细胞形成的早期阶段，其通过与其受体Fgfr3的相互作用调节内指细胞的发育[22, 25-28]。FGF信号通路的激活可以导致转录因子Hey2的表达增加，在耳锅发育过程中阻止指状细胞转化为毛细胞[22]。BMP4则表达于耳锅Corti氏器外侧的小上皮脊，其功能可能与限定Corti氏器毛细胞和支持细胞的数量有关[27，28，29]。
序章转基因小鼠的繁育和基因型确定
材料方法
在含有pTM基因的小鼠体内，外源性的Atohl/Mathl基因位于四环素作用原件TRE下游。在正常情况下，外源性的Atohl/Mathl基因不表达，直到TRE与rtTA和强力霉素结合后，才可以启动Atohl/Mathl基因的表达。在含有rtTA基因的小鼠体内，在rtTA基因的上游有一个可以被Cre重组酶剪切的终止框。当该终止框被Cre重组酶剪切后，rtTA基因开始表达。在含有Foxglcre基因的小鼠体内，Cre重组酶仅表达于表达Foxgl基因的组织(Foxgl在新生小鼠体内表达于内耳所有细胞）。本研究用含有三种基因的小鼠进行杂交，蹄选出同时具有三种基因的小鼠。这种小鼠内耳上皮内的所有细胞均含有rtTA和处于TRE下游的Atohl/Mathl基因，再于不同的时点用含有强力霉素的食物和饮水词喂小鼠，理论上即可在特定的时间内在内耳上皮细胞内表达外源性Atohl/Mathl。
第二章 Atoh1/Math1介导的前庭毛细胞再生................. 39-48
材料方法 ...............39-41
结果............... 41-42
附图............... 42-45
讨论............... 45-47
参考文献............... 47-48
第三章 调节不同信号通路对前庭毛细胞............... 48-56
材料与方法............... 48-50
结果 ...............50-51
附图............... 51-53
讨论............... 53-55
参考文献............... 55-56
结论
本研究使用了在强力霉素诱导条件下能够定时定位表达外源性Atohl/Mathl基因的转基因小鼠模型。在该小鼠模型体内，Foxglcre基因使Cre重组酶仅表达于小鼠内耳组织。在小鼠前庭上皮内，Cre重组酶能切除rtTA基因上游的终止框，使rtTA基因表达。若同时在特定的时点用含有强力霉素的食物飼喂小鼠，则rtTA和强力霉素结合共同作用于外源性Atohl/Mathl基因上游的四环素反应元件TRE,启动外源性Atohl/Mathl基因的表达。本研究首先通过在小鼠生后不同的时点用含有强力霉素的食物和饮水饲喂小鼠，诱导其体内的Aothl/Mathl基因表达，观察Atohl/Mathl基因在不同时点对小鼠椭圆囊发育的影响，判定是否有新的毛细胞产生。然后，本研究在用强力霉素诱导Atohl/Mathl大量表达的同时，对小鼠皮下注射Brdu,通过行Brdu染色，观察在Atohl/Mathl介导的在体前庭毛细胞再生过程中有无细胞分裂和增殖现象。最后，本实验通过体外培养技术，通过药物抑制Notch、FGF和BMP等信号通路，研究了抑制不同的信号通路是否能诱导产生新的毛细胞。本研究得出的主要结论如下：
1.同时包含pTMl、foxglcre和rtTA三种基因的小鼠，行强力霉素诱导后在本研究所涉及的所有时间点均能在前庭上皮内表达外源性Atohl/Mathl
2.在动物体内表达外源性Atohl/Mathl能够诱导产生新的前庭毛细胞，新生的前庭毛细胞主要分布在感觉上皮内的微纹区和近微纹区以及非感觉上皮，新生的毛细胞可被Myo7a标记，并且其顶端有小纤毛族
3.前庭上皮产生新生毛细胞的能力随着生后时间的不断延长而逐渐减弱。至生后第7天，已无法在非感觉区诱导产生新的毛细胞；至生后第21天，亦无法在感觉上皮内的微纹区和近微纹E诱导产生新的毛细胞
4.在新生阳性小鼠的前庭感觉上皮内过量表达外源性Atohl/Mathl可诱发显著的细胞增殖现象，在微纹区和近微纹区细胞增殖现象最为明显
5.部分新生的前庭毛细胞为有丝分裂后的子细胞分化而来，提示Atohl/Mathl诱导产生新生毛细胞的现象可能存在两种机制，一种为先促进细胞分裂，再使子细胞分化为毛细胞；另一种为从支持细胞直接转分化为毛细胞
6.抑制Notch和FGF信号通路能够使前庭感觉上皮内的Atohl/Mathl表达量增力口，并在微纹区和近微纹区诱导产生新的毛细胞
参考文献
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