【摘要】 细胞作用于细胞外基质的力称为细胞牵引力(Cell Traction Force)。它由肌动球蛋白的相互作用和肌动蛋白的聚合作用而产生。据研究发现细胞牵引力受α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的调节,细胞牵引力具有促进细胞移动,感受细胞外基质环境,维持细胞形状,产生传导信号,维持细胞生理特性等功能。细胞牵引力是细胞的一个重要物理参数,它与细胞的许多生物过程有着密切的关系,比如炎症反应、创伤修复、血管生成、信号传导等等。研究细胞牵引力可使人们更完整地认识细胞及其生长发育的变化机理。本实验通过测定小鼠髌腱组织的干细胞分化前后细胞牵引力的变化,研究细胞牵引力在干细胞分化过程中的变化规律。目的:通过测量小鼠髌腱组织干细胞在分化前和分化后不同形态时的细胞牵引力,去探明小鼠髌腱干细胞在分化的整个过程中的细胞牵引力的变化规律,更深入的了解细胞生长发育的变化规律,对细胞的生物学性质更进一步的了解和认识。方法和结论:细胞培养。小鼠髌腱干细胞获取后置CO2培养箱内培养,培养三至四天换液,去除未贴壁的细胞。用倒置显微镜观察细胞生长状态,挑取克隆生长的干细胞扩大培养,每三天传代一次,待大多数细胞具有较好的集落形态时,应用CTFM(Cell Traction Force Microscopy)法测定细胞牵引力。CTFM即显微镜追踪法测定细胞牵引力技术。其基本原理是根据细胞基质弹性表面形变来测算细胞牵引力的一种技术。根据细胞的大小不同置备不同硬度的弹性基质,在制备弹性基质时掺入荧光微珠,以确定基质的形变程度。测定细胞牵引力时,将细胞移种在弹性基质表面,当细胞贴附后会使基质产生形变,此时先用荧光显微镜的普通光源拍摄细胞贴附到基质上的细胞图片,再用荧光光源拍摄基质图片,用1M的NaOH杀死细胞,使细胞脱离基质表面,此时弹性基质将回复原位,再拍摄一张恢复原位的基质图片。将细胞脱离前后的基质形态变化图片,用MATLAB7.0专用自编程序进行比较分析即可测算出细胞牵引力。Western bloting技术测定小鼠髌腱干细胞分化前后α-SMA的含量表达。小鼠髌腱干细胞分化以后,当形态上有了明显的变化形成成纤维细胞以后,其细胞牵引力会明显减小,平均减小30%左右;与此同时α-SMA的含量也发生了相应的变化。小鼠髌腱干细胞分化后细胞牵引力的减小表明干细胞在分化过程中细胞内的分子结构和组成发生了显著变化,尤其是α-SMA的含量发生了变化。这说明在分化过程当中,随着分化过程的进行,α-SMA的基因表达受到了一定程度的限制。荧光抗体技术检测蛋白。利用间接荧光染色法检测蛋白结果显示:小鼠髌腱干细胞分化前后,其内部的蛋白含量发生了明显的变化。小鼠髌腱干细胞分化后的蛋白的含量相对分化前的蛋白含量明显减少,而蛋白含量的减少,说明干细胞的细胞牵引力变小。 更多还原
【Abstract】 Cells generate internal tensile forces through actomyosin interactions and actin polymerization ,they exert tractions on extracellular matrix. This internal tensile forces is referred to as cell traction force(CTF). CTF is regulated by intracellular proteins such as alpha-smoothmuscle actin (α-SMA) and transforming growth factor-β(TGF-β), it is an important physical parameter and is vital for many biological processes, including metastasis,inflammation, wound healing,angiogenesis, cell shape maintenance, and mechanical signal generation. The study of cell traction forces enables us to better understand these cell and the mechanisms of the growth. In this study, Researcher want to find the mechanism of differentiation through measureing the CTF of Patella tendon stem cells before and after differentiation.Object :to find the mechanism of differentiation through measureing the CTF of Patella tendon stem cells before and after differentiation.,and provide new enlighten and thohght for physiology and pathology.Methods and conclusions:Culture cells . Obtaining the cell needed and culturing them in CO2 incubator.After three to four days, remove the cell which not anchorage. Observating the cells with inverted microscope and picking the growth of cells cloned, once every three days, until most cells has good state.The CTFM (Cell Traction Force Microscopy)methods, which use elastic PAG substrate in measuring CTF , using fluorescent beads when fabricate the PAG. and the displacement field can be determined based on the movement of markers on the surface of the PG,we could obtain a pair of“force loaded”and“null force”microscopy images,which is the images we obtain when the cells adhere on substrate and be off.finally, determining the CTF by using the MATLAB and the program which workout .Measureing (α-SMA) of Patella tendon stem cells before and after differentiation by western bloting.Results:CTF of the mouse Patella tendon stem cells were decreased obviously after differentiation when these cells change significantly in morphology. The average of magnitude of CTF were reduced by 30%. The amount of (α-SMA) also be reduced correspondingly.This suggest that the structure and component of Patella tendon stem cells have changed significantly and to a certain extent the expression of a gene.By fluorescent antibody technique to detect protein.Use of indirect fluorescence staining showed protein: Stem cells in mice before and after patellar tendon,the internal protein content has undergone an obvious change. Patellar tendon stem cells in mice after the first differentiation of the relative protein content was significantly reduced protein content, and protein content decreased, indicating that stem cells become smaller traction. 更多还原
【关键词】 髌腱； 细胞牵引力； 变化； CTFM；
【Key words】 Patella tendon； CTF； Variation； CTFM；
小鼠髌腱干细胞分化过程中的力学特性研究
【目录】摘要 5-7
Abstract 7-8
1 绪论 11-21
1.1 细胞牵引力（CTF） 11
1.2 干细胞 11-13
1.2.1 干细胞简介 11-12
1.2.2 干细胞研究意义 12-13
1.3 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA） 13
1.4 western bloting 技术 13
1.5 荧光抗体技术 13-15
1.5.1 荧光抗体技术介绍 13-14
1.5.2 荧光抗体技术的应用 14-15
1.6 本课题研究的目的意义 15-16
1.7 国内外研究进展 16-19
1.8 理论假设 19
1.9 研究目标 19-21
2 实验设计 21-23
2.1 CTFM 法测细胞牵引力 21-23
3 材料和方法 23-37
3.1 主要材料和仪器 23-25
3.1.1 实验动物 23
3.1.2 实验试剂 23-24
3.1.3 实验仪器及耗材 24-25
3.2 实验方法—CTFM 法测细胞牵引力 25-34
3.2.1 实验前准备工作 25-28
3.2.2 细胞的分离和培养 28-30
3.2.3 基质的制备 30-31
3.2.4 细胞移植 31-32
3.2.5 图像拍摄 32-34
3.2.6 图像信息的分析处理 34
3.3 Western bloting 技术检测α-SMA 的表达 34
3.4 荧光抗体技术检测蛋白 34-35
3.5 实验中的注意事项 35-37
4 结果与分析 37-45
4.1 CTFM 法测量小鼠髌腱干细胞分化前后细胞牵引力 37-41
4.2 小鼠干细胞分化前后α-SMA 含量表达 41-42
4.3 小鼠髌腱干细胞分化前后蛋白含量的表达 42-45
5 讨论 45-47
参考文献 47-55
在学期间研究成果 55-57
致谢 57-58
【参考文献】[1] 高淑云. 小鼠干细胞牵引力在分化过程中的变化研究[D]. 沈阳大学 2011
[2] 李玲巧. 细胞培养芯片的研制及芯片内骨髓间充质干细胞分化控制的前期研究[D]. 厦门大学 2009 [3] 刘琴丽. 铺展形状和面积调节成骨细胞的凋亡[D]. 重庆大学 2010
[4] 汪蕾. “心肌样”环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究[D]. 武汉大学 2005 [5] 张鹏. Rho激酶抑制剂对小鼠胚胎干细胞分离与生物学特性的影响[D]. 河北农业大学 2010
[6] 兰海. 前脂肪细胞与小肠粘膜下层构建组织工程脂肪的体外实验研究[D]. 四川大学 2004 [7] 孙雪萍. 利用限定因子诱导牛iPS细胞[D]. 安徽农业大学 2010
[8] 李卉. 中华眼镜蛇（Naja naja atra）毒神经生长因子对PC12细胞阿片受体表达的影响[D]. 重庆师范大学 2008 [9] 孟书燕. 小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用[D]. 西北农林科技大学 2011
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