1 前 言
赖氨酸和蛋氨酸是人类和动物营养需求所必须的两种重要限制性氨基酸，在动物体内会影响其它氨基酸的利用率。为了满足动物需要和促进动物生长，在饲料中适当的添加限制性氨基酸，这样不仅可以节约蛋白质资源，而且还可以促进动物生长并能提高饲料日粮的利用率。饲料中添加的氨基酸主要来源于微生物发酵和化学合成。化学合成的氨基酸生产技术比较复杂，产生的副产物多，不能直接添加，而且价格昂贵。通常微生物发酵法生产的氨基酸的生物效率要高于化学合成法，再加上益生菌产生的氨基酸是绿色、无毒、无污染和安全可靠的，所以通过发酵后的益生菌（发酵液中含赖氨酸和蛋氨酸）可以作为饲料添加剂直接添加到饲料中去。
1.1 赖氨酸在畜牧业上的应用
赖氨酸也称为 L-赖氨酸盐酸盐，它的化学名称为：2,6-二氨基己酸或 α,ε-二氨基己酸；英文名称为 Lysine，缩写为：Lys；化学结构简式为：H2NCH2CH2CH2CH2CH(NH2)COOH，相对分子量为 182.65。赖氨酸是人和动物在营养需求上的 9 种必需氨基酸中的第一必需氨基酸，赖氨酸有 L-型（左旋）、D-型（右旋）和 DL 型（消旋）三种旋学异构体。其中只有 L-型可以供人及动物吸收利用。L-赖氨酸是人及动物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，被广泛用于饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面，其中 90%以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂[1]。L-赖氨酸盐是赖氨酸的 L 型旋光异构体；外观为白色或浅褐色结晶粉末，无味或稍带特殊气味，易溶于水，难溶于乙醇和乙醚，有旋光性，熔点 263～264℃，我国已制定了饲料添加剂 L-赖氨酸盐酸盐国家标准（GB8245～87）。
1.1.1 赖氨酸的微生物合成途径
目前，赖氨酸的生物合成途径主要是微生物发酵法，它是当今世界上生产赖氨酸的主要方法，年产量在 100 万 t 以上。微生物发酵法可分为添加前体发酵法和直接发酵法两种。L-赖氨酸生物合成存在两个完全不同的途径：二氨基庚二酸途径（即添加前体发酵法）和 α-氨基己二酸途径（即直接发酵法），分别由不同的酶进行调节，控制 L-赖氨酸的合成。（1）二氨基庚二酸途径（DAP 途径）：二氨基庚二酸途径又称天冬氨酸途径，是从天冬氨酸开始的通过二氨基庚二酸的代谢途径。细菌、原生虫、某些真菌、一些藻类和高等植物是通过该途径生产赖氨酸。细菌的 L-型赖氨酸生物合成途径如图 1-1 所示。
1.1.2 赖氨酸作为饲料添加剂的功效
赖氨酸是植物性饲料（除豆粕外）中最缺乏的一种氨基酸。在饲料中直接添加赖氨酸被证明是非常有用的，它不会导致超出他们需要的其它氨基酸额外的吸收和代谢，可以避免多余的氨的形成以及在肥料中因氮含量的增加所形成的环境负担[3]。在现代畜牧养殖业和饲料工业中，工业生产的赖氨酸占有非常重要的地位，可以毫不夸张地说，没有工业赖氨酸，现代养殖业是不可想象的。工业生产的赖氨酸至少发挥着下面几个方面的作用：（1）改善饲料氨基酸的平衡，促进动物生长发育：动物在生长期，细胞增殖旺盛，特别需要蛋白质作为机体发育的原料。实践证明，在饲料中添加适量的 L-赖氨酸、DL-蛋氨酸，就能增加动物机体内蛋白质的合成，从而促进动物的生长发育。曾佩玲等（2009）研究表明在 20~35g 的生长猪的日粮中添加赖氨酸会对显著提高猪血清中的丝氨酸、谷氨酸等许多氨基酸的含量，从而促进猪的生长发育[4]。（2）改善肉质，提高产奶、产蛋量：饲料中添加 L-赖氨酸，可使猪的胴体外观好，肉质味道鲜，皮变薄，瘦肉率高。当饲料中每日补加 30g 蛋氨酸喂奶牛，每天每头可多产奶 1.5~1.6kg，对老奶牛效果更显著。（3）节省蛋白质饲料，使饲料得到充分利用：有时，饲料中含的蛋白质可能比动物实际需要的还多，因而造成蛋白质浪费和氨基酸失衡。如在饲料中添加适量的蛋氨酸和赖氨酸，可校正氨基酸的平衡，提高蛋白质的利用率，并有节省高价蛋白质的作用。实践证明：1t 蛋氨酸可节省 100t 饲料，相当于 20000m2饲料地的经济效益。1t L-赖氨酸可节省 125t 饲料，可多生产 10~16t 猪肉或8t 鸡肉，或者 25 万个鸡蛋。（4）降低成本，提高饲料利用率。此外，氨基酸添加剂还有用量少、效率高、易贮存、使用安全、无副作用等特点。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验材料
原料：辣椒花药（采自东北农业大学农场）；玉米种子（农大 108）由本实验室保存。菌株：E. coliTOP10，购自大连宝生物科技有限公司；野生型枯草芽孢杆菌（B.subtilis）168 为本实验室保存。质粒载体：pMD18-T 载体，购自大连宝生物科技有限公司（图 1-1）；枯草芽胞杆菌表达载体 pHT43 购自德国分子生物技术（Molecular Biotechnology）公司（图 1-2）。
2.1.2 培养基
LB 液体培养基：1%Typtone；0.5%Yeast extract；1%NaCl；pH 7.0~7.4；制作固体培养基时需加入 1.5%琼脂，115℃，20min 湿热灭菌。BY 培养基：牛肉膏 5g，酵母膏 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000mL，pH7.5。1×最低盐溶液：K2HPO414g（K2HPO4•3H2O 18.34g），KH2PO46g，(NH4)2SO42g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O）1g，MgSO4•7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至 1000mL。L-trp 溶液：2mg/mL，贮于棕色瓶内，用黑纸包裹。生长培养基：GM，使用时混合比例。1×最低盐溶液 100mL，1M 硫酸镁 0.5mL，50%葡萄糖 1mL，5%水解酪蛋白 0.4mL，10%酵母汁 1mL，L-trp 50ug/mL。转化培养基：TM，使用时混合比例。1×最低盐溶液 100mL，1M 硫酸镁 0.5mL，50%葡萄糖 1mL，5%水解酪蛋白 0.2mL，L-trp 5ug/mL。
2.1.3 实验药品
Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司； Reverse Transcriptase M-MLV（ RNase H-）、ClonedRibonuclease Inhibitor、dNTP Mixture（10uM和2.5uM）、Oligo d(T)15Primers、Ex Taq酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶以及蛋白Marker，都购自大连宝生物科技有限公司；氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）购自上海生工生物工程公司；L-赖氨酸标准品和1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）均购自SIGMA；DL-蛋氨酸标准品（色谱纯）购自天津市光复精细化工研究所；DL-蛋氨酸砜标准品购自Alfa Aesar；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Axygen公司；引物由北京英俊公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯。
3 结果与分析 ......29
3.1 基因的扩增 .....29
3.1.1 高赖氨酸蛋白基因 Cflr 的扩增....29
3.1.2 高蛋氨酸蛋白基因 zein 的扩增....31
3.2 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/Cflr .........34
3.2.1 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/Cflr 构建 ......34
3.2.2 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/zein 的构建 ........34
3.3 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/Cflr .........36
3.3.1 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/Cflr 的转化 ........36
3.3.2 枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/zein 的转化 ........36
3.3.3 重组质粒 pHT43/Cflr 和 pHT43/zein 的稳定性 .........38
3.4 pHT43/zein 在 mRNA 水平的表达 .........38
3.5 pHT43/zein 在蛋白水平的表达 ........39
3.6HPLC 检测重组菌发酵液中赖氨酸........40
4 讨论 .....44
4.1RNA 的提取 .....44
4.2 目的基因的克隆....45
4.3 表达载体的构建....46
4.4 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备.......47
4.5IPTG 诱导枯草芽孢杆菌中目的基因的表达 .........48
4.6 重组菌中 Lys 和 Met 含量的测定 .......48
4.7 重组的枯草芽孢杆菌.........49
5 结论 .....51
结论
通过 RT-PCR 方法克隆了高赖氨酸蛋白基因 Cflr 的全部编码区域，长为 720bp 的片段，序列测定后与 NCBI（基因登录号：EU367999）上的序列进行 Blast 分析，同源性为 99%，证实获取的基因片段为 Cflr 的基因序列；通过 RT-PCR 方法克隆了高蛋氨酸玉米醇溶蛋白基因 zein 的全部编码区域，长为 476bp 的片段，序列测定后与 NCBI（基因登录号为：541922dzs10）上的序列进行 Blast 分析，同源性为 99%，证实获得的片段为 zein 基因序列。
该研究成功的构建了枯草芽孢杆菌表达载体 pHT43/Cflr 和 pHT43/zein，并将这两种表达载体先后成功转入枯草芽孢杆菌并表达，通过 qRT-PCR 结果表明高赖氨酸蛋白基因和高蛋氨酸蛋白基因在 mRNA 水平均有表达；通过 SDS-PAGE 结果表明，在 24kD 和 16kD 处分别出现了一条蛋白条带，与目的蛋白大小相符。
重组菌和野生菌经发酵后，通过 HPLC 测定发酵菌液中赖氨酸和蛋氨酸的含量，发现重组菌液中 Lys 含量比野生型菌液提高了 16.05%（n=5），Met 含量提高了 24.94%（n=5）。
参考文献
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