1. 文献综述
1.1 生物矿化
生物诱导的矿化作用受环境的影响较大，没有专门的细胞组织或生物大分子调控，形成的晶体取向随意。而生物控制的矿化作用是在不受外界环境影响的，在少量有机基质的精确调控下，在生物体的特定部位，经历核化、生长和相变等过程，最终形成具有独特晶体习性和规则晶体排列的生物矿物聚集体的过程[4]。本论文中所讨论的生物矿化就是生物控制的矿化作用。软体动物贝壳和珍珠的形成是受有机大分子控制最为典型的生物矿化过程。形成的贝壳主要是由包括方解石和文石结晶与有机基质紧密结合而组成的高度有序的多重微层结构，由于有机基质的参与使得贝壳和珍珠这种高度有序的晶体复合物与无机成因的 CaCO3晶体相比而言有很多特殊的性质，如极高的强度、优秀的断裂韧性、减震性能、表面光洁度以及其它许多特殊的功能[5]。为纳米材料、仿生材料等新型材料的开发提供新思路[6-7]。同时贝壳和其衍生物珍珠因其光泽的外观、美丽的形状而成为人们喜爱的装饰品之一，具有很高的经济价值。珍珠也是一种非常有价值的药物，早在 2000 多年前中美洲将其应用于牙齿的移植[8]。在我国古代，如六神丸、镇惊丸、等 20 余的中药中使用了珍珠粉等。现在的外科整形手术中，珍珠粉也被广泛用于刺激造骨细胞的生长[9]。近年来还发现将珍珠质移植进哺乳动物或者人体的骨骼系统而没有发生排异反应，这为将珍珠质用于治疗人类骨质疏松症以及骨骼损伤等相关疾病带来期望[10-13]。因此，对贝壳和珍珠成因的大分子及其调控机制成为国内外学者们研究的热点。
1.2 马氏珠母贝贝壳与珍珠形成研究现状
1.2.1 贝壳的超微结构
贝类生物矿化作用的最终产物是贝壳或珍珠。贝壳的形态多变，但是一般而言软体动物的贝壳从外向内依次分为外侧的有机层(角质层)与内部的钙化层[14]。角质层（periostracum）是由硬化蛋白构成极薄的未矿化有机层，内部的钙化层是生物矿化形成的，由外侧茶褐色的棱柱层（prismatic layer）和内侧有光泽的珍珠层（nacreouslayer，nacre）组成[15]。两者矿化的结晶的形态是不一样的，棱柱层主要的碳酸钙晶体是方解石(acclite)，而珍珠层主要的碳酸钙晶体是文石(arganotie)，两种晶型主要区别在于晶体中 Ca2+与 CO32-的距离不同而导致稳定性不同。在热力学角度，方解石要比文石略为稳定一些。扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）下棱柱层通常是由大量平行排列的柱状方解石晶体构成[16]，其横截面呈多边形，每个多边形的柱状晶体都由一层有机基质包围[17]。贝壳的珍珠层由文石晶体沉积而成，电镜下观察到其中单个的文石板块约厚 0.4-0.5μm、宽 5-10μm，呈拟六方体形，各板块（tablet）按层状紧密排列成“类似密缝式砌砖” 结构，文石板块间以及层状结构间由有机基质填充，使得文石片层的排列非常紧密[18-19]。文石晶体的这种“密缝式砌砖结构”与有机基质相的紧密结合，使得珍珠层抗断裂能力较单纯的文石晶体高出 3 个数量级，也使得珍珠层成为材料学研究的热门材料之一[18],[20-26]。除此之外，贝壳的钙化层还有许多不同的构造，较为常见的有方解石沿贝壳方向一层层排列形成的叶状层，以及由片状的文石晶体交叉平行排列而形成的交错层纤层[27-28]。关于珍珠的形成也是生物矿化研究的热点之一[29-31]。由于珍珠的形成基本与贝壳珍珠质的形成相似，只不过前者是珍珠囊的产物，后者是外套膜的产物。珍珠囊细胞分泌出珍珠质在外来物质周围形成文石碳酸钙沉积，最终形成珍珠[32]。所以珍珠其实就相当于球形的贝壳。研究珍珠层形成机理，对于揭示珍珠和贝壳形成的奥秘，促进珍珠产业的发展，开发珍珠产品的应用都具有重要的意义。
2.DPT 基因的克隆表达与功能研究
2.1 引言
贝壳形成是一个非常复杂、精密调控的过程，贝壳各层的形成既有其自身的特点，离手段及蛋白含量较少等因素的限制，对蛋白功能的研究还停留在推测阶段。目前，贝壳基质蛋白的分离与纯化工作刚刚开始，生物矿化相关功能基因的分离鉴定更是方兴未艾。已有的研究表明，自然条件下构成贝壳的碳酸钙晶体并不是在单一蛋白作用下形成的，而是多种蛋白共同作用的结果，不同蛋白的表达受到严格的调控。因此，不仅应该对贝壳基质蛋白及其基因做进一步分离和筛选，同时还应该对可能在矿化过程具有调控作用的蛋白进行分离鉴定，并深入研究相关蛋白在贝壳形成过程中的作用机制。皮连蛋白广泛存在于各类动物的细胞外基质中，行使着细胞间的相互作用和基质的组装作用。此外皮连蛋白在脊椎动物一些矿化组织中存在，比如骨骼和牙齿等[136]，在骨骼和牙齿的形成过程中起到非常重要的作用。在贝类中皮连蛋白初次提取于淡水光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的交错层纤，被认为是贝壳基质蛋白中重要的组分[56],[137]，同时是不可溶的基质蛋白。因此推测它在生物矿化中为晶体的结晶、成核、生长提供结构上的支持[138]。因此对皮连蛋白的功能和作用机制研究对揭示贝壳和珍珠的矿化机制打开了一扇门。
3 TOLL 样受体基因的克隆表达与功能研究............. 39-46
3.1 引言............ 39-40
3.2 材料............ 40
3.3 方法............ 40
3.4 结果............ 40-44
3.4.1 TLR3 RACE 的结果............ 40-41
3.4.2 TLR3 RACE 的序列分析............ 41-42
3.4.3 TLR3 荧光定量的结果............ 42
3.4.4 TLR3 RNA 抑制试验的结果............ 42-44
3.5 讨论............ 44-45
3.6 小结............ 45-46
结论
（1）RACE 获得 TLR3 894bp 的部分 cDNA 序列，该片段可编码 168 个氨基酸，3’-UTR为 385bp，polyA 长 13 个 A。
（2）qRT-PCR 检测 TLR3 基因在 8 个组织中均有表达，在血淋巴中表达最为明显，其次是在闭壳肌中，在其他组织中表达较为稳定。
（3） RNA 抑制试验结果：当 TLR3- dsRNA 探针注射量达 5ug 时 TLR3 的表达量下调 17%，注射量为 30 g 时，TLR3 表达量下调 49%。注射 PolyI:C(500 g)后 TLR3 的表达量上调了 52.2%。
（4）NF-κb 的变化：当 TLR3- dsRNA 注射量为 30 g 时，NF-κb 表达量下调 52.29%.注射 PolyI:C(500 g)后 NF-κb 的表达量上调了 57%。相同的处理情况下 NF-κb 的表达变化与 TLR3 的变化一致。
参考文献
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