1前言
LI —族 LEA 蛋白（D-19)
在低温、干旱、盐渍等逆境条件下，植物体内的基因表达和酶的活性会发生一系列变化，这些变化可以影响植物的生长发育和产量。为维持正常新陈代谢活动，植物会产生一系列具有保护功能的亲水性蛋白来保护自己。胚胎发育晚期丰富蛋白（Lateembryogenesis abundant proteins, LEA proteins)便是其中重要的一种，它可以降低逆境胁迫对植物产生的伤害。LEA蛋白最早发现于31年前，其具有较高的亲水性和热稳定性，含有高比例的甘氨酸、赖氨酸和组氨酸，缺少丙氨酸和丝氧酸，缺乏明显的二级结构(Dure和Galau, 1981； Thomashow等，1998)。在结构上，大部分LEA蛋白在溶解状态下都处于无序状态。根据LEA蛋白保守结构域的不同可以将其分为不同的家族。虽然在不同家族的LEA蛋白间尚未发现明显的保守结构域，但大多数LEA蛋白都具有甘氨酸比例高于6%和亲水系数大于1的理化特征（Ali-Benali等，2005； Tolleter等，2007； Battaglia等，2008; Bahmdorf傳，2009)(图1-1)。一族LEA蛋白最早发现于大豆种子中，其中D-19与D-132比较具有代表性。在一族LEA蛋白的中部存在由20个氨基酸组成的保守结构域，这个结构域在蛋白中通常可以重复出现多次（Galau等，1992； Baker等，1995)。植物中的一族LEA蛋白通常还具有另外两个保守结构域，分别是位于N端的结构域（TVVPGGTGGKSLEAQE[HyN]LAE)和位于C端的结构域（D[KyE]SGGERA[A/E][E/R]EGI[E/D]IDESK[F/Y])。一族LEA蛋白在水中以高度无序的结构存在，含有高比例的极性氨基酸，其中甘氨酸的含量一般都高于18%,这些特性都使得该族LEA蛋白具有较高的亲水性。圆二色谱法（CD)分析发现，这类蛋白在水中约70%-82.5%的氨基酸处于自由螺旋结构，只有一小部分氨基酸处于左手螺旋或poly-(L-Pro>type (PII)构象。核磁共振分析发现，一族LEA蛋白的结构具有较高的灵活性和不稳定性（Eom等，1996; Russouw等，1997； Soulages等，2002)。
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1.2 二族 LEA 蛋白（D-11)
二族LEA蛋白也称为脱水素，其最早发现于大豆的胚胎组织中。二族LEA蛋白是LEA蛋白家族中结构特征最为明显的一类。二族LEA蛋白在植物中分布广泛，一般具有高比例亲水的极性氨基酸，缺少色氨酸和半耽氨酸（Garay-Arroyo等，2000; Abba等，2006； Kara, 2010)。脱水素最显著的特点是含有15个氨基酸组成的富含赖氧酸的保守K结构域（[E/H]KKGIMDKIKEKLPG)，该结构域在蛋白质中最高可以存在11个拷贝。脱水素还具有被称为Y片段（[V/T]D[E/Q]YGNP)的保守结构域，该保守结构域存在于多肽的N端，最高有35个拷贝（Close等，1993; Close, 1996； Campbel靡Close，1997)。部分脱水素含有由一串丝氨酸组成的被称为S片段的保守结构域（SSSSSEDD)，该结构域可以被多种蛋白激酶憐酸化（Vilardell等，1990； Plana等，1991； Goday等，1994;Jiang和Wang，2004)。部分脱水素在两个K结构域之间还存在保守性稍差的富含极性氨基酸的①结构域。根据脱水素的这几个保守结构域的位置以及数目的差异，可以将脱水素分为5个不同的亚家族：Kn，SKn，YnSkn, YnKn,KnS。Kn亚家族只含有一个或多个K结构域。SKn亚家族除含有K结构域外，在多肽的中部含有一个S结构域。不同于SKn型脱水素，KnS型脱水素的S结构域位于多肽的C端（Campbell和Close, 1997; Van den Dries等，2011)。
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2材料和方法
2.1实验材料
2.1.1植物材料
玉米（Zea TwajAS L., Zhengdan958)由山东省农业科学院提供，普通烟草(Mcoticinatobaccum, NC89 )及本生烟QNicotiana benthamiana)种子为本实验室保存。
2.1.2菌株与质粒
大肠杆菌菌株为E.coli DH5a,农杆菌菌株LBA4404，酵母菌菌株GS115均由本实验室保存。克隆载体（pMD18-T Vector)购自TAKARA公司。原核表达载体pET30a，酵母表达载体pPI3.5k，双子叶植物双元表达载体pBI121和pBI121-GFP为本实验室保存。
2.1.3酶及生化试剂
RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、蛋白纯化试剂盒、DNA胶回收试剂、蛋白Marker为北京天根生化科技有限公司产品；DNA聚合酶、T4-DNA连接酶、dNTP、DNA聚合酶、DNAMarker为北京全式金公司产品；限制性内切酶、异两基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)为TAKARA公司产品；反转录试剂盒为MBI公司产品；氨节青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、利富平（Rif)、甲醜胺、P-巯基乙醇、梓檬酸钠、苯酷、氯仿、SDS、Tris、EDTA、NaCK H2O2、NaOH、KAc、NaAc.丙酮等化学试剂为天津凯通产品；Hybond-N+尼龙膜购于Amersham公司。YPDA等酵母培养基、酵母双杂交相关试剂盒、Aureobasidin A (AbA)、X-a-Gal 购于 Contech 公司。
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2.2实验方法
2.2.1植物材料总RNA的提取
植物RNA的提取釆用天根的试剂盒。
(1)均匀处理：50-100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，润旋剧烈震荡混勻后56°C孵育l-3min。
(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），12000rpm离心2-5min,小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225tiL)，混勻（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(4)向吸附柱CR3中加入35HiL去蛋白液RW1, 12000ipm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
(5) DNasel工作液的配制：取lOmiLDNasel储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70tiLRDD溶液，轻柔混勾。
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3结果与分析......... 34
3.1玉米基因组LEA蛋白的鉴定......... 34
3.2玉米二族LEA蛋白基因ZmDHN13的分离及功能分析......... 36
3.3玉米三族LEA蛋白基因ZmLEA3的分离及功能分析......... 52
3.4玉米五族LEA蛋白基因ZmLE5C的分离及功能分析......... 55
3.5烟草响应主要依赖SA信号途径......... 70
4 讨论 .........75
4.1 KS型脱水素ZmDHN13的作用机制......... 75
4.2玉米三族LEA蛋白ZmLEA3的作用机制......... 77
4.2.1 ZmLEA3参与非生物胁迫......... 77
4.2.2 ZmLEA3参与生物胁迫......... 78
4.3 ZmLEA5C提高转基因烟草对低温胁迫和渗透胁迫的抗性......... 78
4.4不同家族LEA蛋白间的功能和作用机制存在异同点......... 78
4.5烟草响应Pst DC3000主要依赖于SA信号途径......... 79
5结论 .........80
4讨论
LEA蛋白是在种子胚胎发育晚期富集的一类小分子量，且具有较高亲水系数的蛋白。LEA蛋白对减轻低温、高盐、渗透胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫对植物的伤害具有明显的作用（Embryogenesis 等，2011; Kovacs 等，2008; Rorat 等，2006; Xing 等，2011； Qiu等，2013； Yamasaki等，2013)。研究表明，LEA蛋白在逆境条件下具有保水和保持蛋白质结构和功能的作用（Tuimacliffe等，2007； Kovacs等，2008)。近几年研究发现，LEA蛋白对部分生物胁迫也具有一定的响应（Salleh等，2012; Zhu等，2013)。许多实验都从侧面佐证，LEA蛋白在逆境条件下可以与蛋白质结合来保护其活性，并且本研究的体外实验也发现LEA蛋白的确可以保护LDH的活性，但通过酵母双杂交实验未发现这三个LEA蛋白可以与酶（LDH，CS, SOD, APX)发生互作，这说明LEA蛋白可能有更为复杂的作用机制。
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结论
(1)以拟南芥蛋白基因为模板进行同源比对，共在玉米基因组中比对得到29个分属于6个不同家族的LEA蛋白基因。
(2)从玉米中分离得到分属于二族、3A族和5C族的LEA蛋白基因ZmDHNlS、ZmLEAS 和 ZmLEASC。
(3) ZmDHNlS和ZmLEA5C是组成型表达，并且其表达也受到各种非生物胁迫和信号分子的调节。ZmLEA3是典型的诱导型表达LEA蛋白基因。ZmLEA3和ZmLEA5C同时参与生物胁迫和非生物胁迫响应。
(4)选轰达ZmDHN13、或都可以提高转基因植株对渗透胁迫的抗性。ZinDHN13和ZmLEA3可以结合金属离子，并且提高转基因植株对氧化胁迫的抗性。ZmLEA5C可以提高转基因植株对低温胁迫的抗性。
(5) ZmDHNlS和ZmLEA5C可以被蛋白激酶CKII磷酸化。S结构域和NLS结构域对ZmDHN13的憐酸化具有重要作用。ZmLEA5C的磷酸化机制尚不明确。
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参考文献（略）