1绪论
1.1同源重组
生物在进化的进程中，不同个体间的基因交流，同一个体内基因组的遗传重组可在较短的周期内迅速产生各种基因型个体，广泛地参与自然选择的竞争，从而使群体的遗传基础始终处在优良基因不断积累，不利基因不断淘汰的进化之中。从这一意义上讲，我们可以认为，每一个生物界的个体都是遗传的重组体。这种重组技术包括同源重组、位点特异性重组、非同源重组以及转座重组等⑴。同源重组又称一般重组，是染色体之间进行遗传信息交换的方式之一，几乎所有的生物体中都发生这类重组方式，如真核生物姐妹染色单体的交换；细菌及某些低等真核生物的转化；细菌的转导，接合等都属于同源重组范畴。另外，同源重组常发生在DNA受损伤的细胞中，是对损伤DNA进行修复的一种重要途径。同源重组技术是一项分子生物学实验中常用的技术手段，在基因克隆和基因敲除方面有很广泛的应用。
1.1.1同源重组的分子模型
对于同源重组的过程目前有三种被广泛接受的模型，分别是Holliday双链侵入模型、单链侵入模型（Meselson-Radding模型）和双链断裂修复模型（Szostak模型）[2]。一、Holliday双链侵入模型1964年Holliday在对真菌的基因转换遗传机制的研究中，首次提出了一个异源双链交叉结构模型，又称Holliday模型。这个模型的两个关键点是在重组过程中有DNA链的断裂和重接，并且形成Holliday连接体结构。但在Holliday模型中，没有DNA复制现象。通过电镜观察和分子生物学研究证明，在重组过程中确实存在Holliday连接体结构。Holliday结构也是其他模型所共有的重组巾间体。Holliday双链侵入模型己被作为一个标准模型而被广泛接受。然而这种模型存在的一个问题是两个DNA分子必须同时几乎在同一部位被切断而引发重组，而这种情况在生物体内发生的几率较低[2]。二、单链侵入模型（Meselson-Radding模型）单链侵入模型是由Meselson和Radding在1975年提出的，在这一模型中，他们对Holliday模型做了一些补充和修改。单链入侵模型的解释是两个DNA分子中的一个单链在随机部位被切断，然后暴露的末端侵入到另一个双链DNA分子，直到发现它的互补序列。如果它发现这样一个序列，它将替代一条与它相同的链，然后DNA聚合酶用留下的那条链作为模板填充侵入链留下的缺口。被替代的链则会被降解，它残留的末端与另一个分子中新合成的DNA链相连接形成Holliday连接体。一旦Holliday连接体形成，便像Holliday模型一样，产生异构化，然后拆分。在这个模型巾，可以产生不对称的异源双链。三、双链断裂修复模型（Szostak模型.）1983年Szostak研究醜酒酵母遗传重组后提出了双链断裂修&模型。Szostak模型的解释是：首先参与重组的一对DNA分了?之一要发生链的断裂，断裂的原因可以是核酸内切酶切断或者是在其他因素的作用造成DNA双链断裂，然后在核酸外切酶作用下扩增成为一个缺口，并在一种或几种核酸内切酶的作用下产生3’单链突出的粘性末端，这两个游离的3’末端之一侵入到另一个双螺旋DNA的同源区，置换供体双链DNA的一个单链而形成一段双链DNA，并产生一个D-环。DNA聚合酶以3’末端为引物，以解开的单链DNA为模版进行复制和修复，最后形成两个Holliday连接体。最后同前两个模型一样这两个Holliday连接体被拆分。总之，关于原核生物和真核生物遗传重组的模型主要有上述3中类型。这3种模型实际上是相互联系和相互补充的，越来越多的研究证明，双链断裂引起的同源重组更为普遍。
1.2 RecA重组系统
RecA重组系统是大肠杆菌自身带有的非外源的源重组系统，该系统主要由RecA蛋白和RecBCD复合蛋白组成。RecA蛋白在离体条件下，能促进同源DNA分子间的同源联会、配对、链交换和分支迁移，是重组过程中最重要的蛋白质RecA蛋白有两个主要特征：（1)单链DNA结合活性：RecA蛋白可以大量地同单链DNA结合，平均一个RecA单体能与4个核苷酸结合，此过程需要ATP; (2)依赖于DNA的ATP酶活性：在DNA存在时，RecA蛋白质能够水解ATP，从而促进链交换。研究表明，RecA蛋白催化的同源配对和链交换过程分三个阶段：预联会，即RecA蛋白聚集在由RecBCD酶作用而产生的3’末端突出的单链DNA上，形成核酸蛋白丝状复合物；（2)联会，即联会完成后，RecA蛋白启动与之结合的单链DNA寻找同源双链DNA，并使单链DNA和双链DNA纵向配对，形成RecA-单链DNA的三元复合物；（3)链交换，即单链DNA在完成同源配对后，侵入双链DNA巾替换掉同源部分，单链DNA自身与互补链进行碱基配对，然后形成一个D-环。
2短同源臂介导的大肠杆菌基因的敲除
2.1材料与仪器
DNA转化过夜培养后长出单菌落，挑若干个单菌落分别到含氨节青霉素10(Vg/rnL的LB液体试管中，过夜培养后提质粒验证质粒是否转化到大肠杆菌细胞中。质粒DNA的小量提取用碱裂解法:(1)取1.5mL过夜培养的菌液用，弃上清收集菌体；（2)往离心管中加入100 (iL S I，用移液枪吹打使菌体重悬；（3)加入200细胞裂解液811,温和地上下颠倒离心管几次至溶液变得清亮粘稠，此过程不要超过5min; (4)加入150 SIII，上下颠倒离心管10次左右，离心管巾会出现白色絮状沉淀，将离心管于-2(rC巾静置5min; (5) 12000rpm,室温离心5min (或者省去-2(rC静置5min，直接12000rpm, 4°C低温离心10分钟），小心的吸取上清到另一个干净的离心管中；（6)加入等体积的酚氯仿，在祸旋混合器上振荡5s，12000rpm离心Imin，小心地将上层水相转移到新的干净的离心管；（7)重复操作（6) 1次；（8)加入2?2.5倍体积的无水乙醇，在祸旋混合器上振荡混和均勾后放置在-2(rC冰箱巾约20分钟；（9) 20分钟后取出离心管12000 rpm，4°C离心5分钟，用70%的乙醇清洗白色沉淀2次，倒扣自然瞭干沉淀；（10)加入20-30L ddHsO溶解沉淀。质粒提取后于-20°C保存。
3长同源臂介导的大肠杆菌基因的敲除.......... 25
3.1实验材料......... 25
3.1.1菌种和质粒 .........25
3.1.2主要工具酶和化学试剂......... 25
3.1.3引物合成......... 25
3.1.4培养基和缓冲液的配制......... 25
3.2实验方法......... 25
3.3实验结果......... 27
3.3.1重叠延伸结果验证......... 27
3.3.2 upp 敲除 PCR 验证......... 29
3.4讨论 .........29
4 DH5α upp的应用......... 31
4.1实验材料......... 31
4.2实验方法......... 32
4.3实验结果......... 37
4.4讨论......... 44
5 结论......... 46
结论
1、本研究利用Red同源重组技术从分子水平对常用大肠杆菌DH5a进行改造，获得了 upp基因敲除的菌株DH5a -Auppo采用了两种敲除方法，参考Datsenko等的娃因敲除策略，）H50bp长度同源臂做引物，合成基因?组线性片段。二是通过重叠延仲PCR融合上下游同源臂，克隆出基因重组线性忭段，利州upp坫因本身做反向筛选标记来达到敲除了的筛选目的。结果表明，用长同源臂的敲除效率要高于短同源臂。
2、成功地将DH5a -Aupp用作非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶正负筛选系统的宿主菌。用iodoPheRS进行试验，结果表明DH5a可以满足筛选系统的要求，为进一步筛选其他非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶积累了一定的基础。
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