1绪论
菊花是我国的传统名花，然而其开花期问题是影响人们四季赏菊最重要的限制因素。菊花的生长状态和花期往往受到生长季温度，日长等环境因子的影响(Langton，1977。按照花期不同，菊花可以分为秋菊、寒菊和夏菊3种类型。然而，大部分菊花品种一般需要经过一定时数的短日照才可以进入花芽分化阶段，所以菊花的自然花期主要集中在11月前后，仅少数光周期不敏感的品种能在夏季或早秋开花，这在一定程度上限制了其观赏性和市场适用性(Anderson, 2006; Zhao et al, 2009)。育种学家曾试图分析出温度、光周期等对菊花花期的影响，以便实现菊花的周年生产，但使用这些方法调控菊花的花期效果十分有限(Cathey，169)。利用分子育种手段改良菊花的花期具有广阔的应用前景，但首先需要了解菊花的成花机理。针对菊花遗传背景复杂、成花机理研宄进展缓慢的特点，本文作者以菊花野生近缘种一甘菊(C.lamndulifolium)作为研究材料，首先利用Illumina/Solexa Hiseq2000平台获得了甘菊转录组信息，然后利用升级版数字芯片表达谱技术(Digital gene expression; DGE)技术蹄选到在甘菊现蕾时特异性表达的基因类群，对其中的花分生组织特征基因DFL和DenFUL进行了功能验证。以期初步解析甘菊成花的分子机理，为菊花花期改良的分子育种提供参考。
1.1研究甘菊成花机理对于菊花花期改良的重要意义
早在七十多年前，俄罗斯植物学家尼古拉.瓦维洛夫就预测野生近缘种将会在农业发展中起到重要作用。野生近缘种在数百万年的进化过程中，积累了各种不同的遗传变异；因而遗传多样性十分丰富，而现代栽培品种的遗传多样性却十分贫乏，这一点可以在DNA水平上直观的看到(Tankslyand cCouch, 1997)。另外，野生种在长期进化过程中，积累了许多优良性状，如花期、抗逆性等优良品质，这些性状是育种学家非常感兴趣的。中国拥有丰富的野生花丼资源，但是真正开发应用于观赏植物育种的野生花丼种类并不多。近年来，随着基因组测序等多种技术实现突破，基因组学、表型组学等多门“组学”及生物信息学得到迅猛发展，作物育种理论和技术也发生了重大变革。以分子标记育种和转基因育种为代表的现代作物分子育种技术逐渐成为了全世界作物育种的主流，在我国也正在成为作物遗传改良的重要手段(黎裕等，2010)。然而，在观赏植物中分子育种技术的应用还刚刚起步。使用分子育种技术可以将野生花舟中优良的基因资源导入到观赏植物的栽培品种，以定点定向地改变观赏植物的性状，培育出色彩新奇、形态优美、抗性优良、花期延长的观赏植物新品种。
菊属是一个种间隔离机制不十分完全的类群，大量研究表明菊花是由菊属内多个野生种相互杂交起源的异源多倍体(Dai etal.，2005)，这使得对其分子生物学研究困难重重。甘菊是菊属植物中特有的二倍体物种(2n=2x=18),也是菊花的起源亲本之一,其生物学习性与栽培菊花有一定程度的相似性。此外，甘菊的头状花序在显花植物中处于最为进化的位置，也显示出其成花的复杂性，引起了现代生物学家的广泛关注，成为进化发育生物学研究中一个诱人的模式(Gocal et ai, 2001; Ottoline, 2003)。就目前而言，高等植物成花的分子调控机理虽己在模式植物中已经研究得比较清楚，但关于甘菊成花机理的研究才刚刚起步。根据在拟南芥和作物的研究中取得的成果，分离在甘菊成花转变过程中起关键性作用的花分生组织特征基因，通过正向遗传学和反向遗传学分析其在甘菊成花过程中的作用，对于转基因改良菊花花期有着积极的意义。
1.2高等植物成花机理的研究进展
1.2.1髙等植物成花的重要性
高等植物成花理论在农业生产上有重要的指导意义，并己被广泛地应用于品种繁殖、异地引种、控制花期、调节营养生长和生殖生长等实践中。此外，成花是高等植物发育过程中最引人注目的阶段，并且在植物发育生物学研究中占有极为重要地位。由于在植物发育生物学的研究中人们往往强调从植物中找到对人类而言“重要”性状的形成规律，因此，在过去很长一段时间中植物发育研究的中心问题始终是植物成花诱导的问题。近年来植物发育生物学成为植物科学中的一个前沿领域，很大程度上得益于人们在花发育的遗传控制研宄方面所取得的重大突破。
2甘菊各个生长发育阶段转录组高通量测序
转录组学(transcriptomics)是一门从整体水平上研究细胞中基因转录情况并探讨基因转录调控规律的学科(Huang et al., 2007)。Illumina Solexa高通量测序技术可以检测到低丰度、新的转录本，并帮助研宄者发现待测样本中微小的基因结构变化，该技术己经被广泛应用于相关作物转录组学的研究。目前在Genebank数据库中，菊属植物的8个种仅有7016条序列信息，数据极为有限，这限制了对甘菊开花调控分子机理的研究，使得菊花花期改良的分子育种难以实施(Anderson, 2006)。在本部分研宄中，本文作者利用该技术获得了一批甘菊不同生长发育阶段、胁迫处理以及各种组织的转录本。通过分析，获得了许多与甘菊成花相关基因的重要信息，这为解析甘菊成花机理、利用转基因技术改良菊花的花期提供了重要基础信息。
2.1材料与方法
2.1.1植物材料的处理及RNA提取
为了获得尽可能多的基因资源，本研究选取了包括甘菊不同发育阶段、胁迫处理和多种器官的样本混合后进行测序。甘菊不同发育阶段取材：甘菊种子经次氯酸钠溶液消毒后播种于1/2MS培养基，待植株根系生长至3-4cm时，移栽至12x8的輕石穴盘中，在16h/8h的长日照人工气候室中进行培养。待植株生长至6片真叶后，将其移栽至輕石：草炭=1:1的花盆中，再转入12/12h的短日照气候室中诱导成花。以甘菊生长发育过程中不同阶段和不同光周期诱导的植株为材料，包括长日照(16/8h)营养生长阶段6片真叶植株；短日照诱导：6片真叶植株(12/12h条件下5天后)、8片真叶植株、9-1]片真叶植株、现蕾植株(约13片叶子)、初花期植株、盛花期植株，上述材料取材部位均为植株顶端及其下面2对嫩叶，早晨8 ： 00开始进行光周期处理，取材时间均为17 ； 00(黄河，2012)。
3甘菊幼苗期和现蕾时数字芯片......... 51
3.1材料和方法......... 51
3.2讨论......... 53
3.3结果.........63
4甘菊DfL基因功能的研究......... 70
4.1材料和方法......... 70
4.2结果.........78
4.3讨论......... 97
5甘菊基因功能的研究......... 102
5.1材料和方法......... 103
5.2结果.........105
结论
“秋来谁为韶华主，总领群芳是菊花”。国人的菊花情缘始于魏晋，兴于唐宋，成熟于明清。从原始的野菊，经过两千多年的选育，菊花的人工栽培取得了巨大的成功；其品种繁多，姿态万千。菊花“以一草之微，自本至末无非可食，有功于人者。加以花色香态纤妙闲雅，可为丘壑燕静之娱。”在一定程度上，菊花己经成为中华民族精神的象征。然而，因其固有的生物学属性，开于深秋之际的菊花虽倍受到文人雅士推崇和民众喜爱，雅俗共赏，但仍略有遗憾。现今，如何调整花期以做到四季赏菊、弘扬传统菊花文化，并提高菊花产业效益以增加从业者的收入，始终是菊花育种学家努力的目标。基于此，本文作者以菊花的近缘野生种为材料，使用转基因技术、PCR技术和亚细胞定位等常规分子生物学技术结合转录组高通量测序、升级版数字芯片表达谱和生物信息学等高新技术，初步解析了甘菊成花调控的分子机理这一科学问题。
(1)通过高通量测序成功的构建了甘菊转录组文库，为甘菊成花以及其他生物学研究提供了一个有价值的基因资源库。文库中包含108,738条Unigene，通过蛋白的同源性比对，58,093条Unigene被注释。对这些Unigene进行COG和GO分类，大致了解了整个甘菊转录组的功能。从这些获得注释的Unigene鉴定了 6204条Unigene编码转录因子，这些转录因子分别属于57个家族，其中8个转录因子基因家族与开花相关。此外，还鉴定了甘菊92个与开花相关的同源基因，这些基因分别属于光周期途径、赤霉素途径、春化途径、自主途径和FRI依赖途径。通过参考文献，初步篩选出56个可以用于菊花花期改良的候选基因。
(2)通过升级版的数字芯片表达谱发现甘菊现蕾时特异性表达的基因群。甘菊幼苗期和现蕾时总计有14,406条Unigene上调或者下调表达幅度达到2倍以上。分别从GO条目、代谢途径显著性富集和转录因子差异表达三个角度对这些数据展开分析。基础代谢途径中的糖类和淀粉代谢途径、氣素代谢和新陈代谢途径中基因，以及MIKC、SBP、YABBY. ARF. 和等转录因子家族参与了甘菊成花调控。分析甘菊中光周期途径、赤霉素途径、自主途径和春化途径中重要基因的表达模式发现绝大多数促进幵花的基因在甘菊现蕾时表达量上升。
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