1.前言
1.1鸡传染性支气管炎研究进展
IBV为套式病毒目⑶idovirales、冠状病毒科、冠状病毒属第三群禽冠状病毒的代表株。冠状病毒属包括可引起人与动物呼吸道、消化道疾病的一大类重要病原体。在RNA病毒中，冠状病毒科病毒成员的体积是最大的。它是第一个被发现的冠状病毒。根据遗传学及血清学差异将冠状病毒属分为3个群，第3群包括鸡传染性支气管炎病毒、火鸡冠状病毒及新近分离的鹳冠状病毒、鸭冠状病毒和野鸡冠状病毒等?。传染性支气管炎病毒与火鸡冠状病毒和至少其他9种哺乳动物的冠状病毒同属冠状病毒属的成员，火鸡冠状病毒在蛋白质序列与抗原性方面与哺乳动物的冠状病毒比较接近，传染性支气管炎病毒与它们的差异较大⑴。
1.1.1 IBV形态结构
传染性支气管炎病毒形态多样，但通常为球形，有囊膜，直径80nm-120nm，不分节段的、单股正链RNA病毒。IBV的病毒粒子主要由囊膜和核衣壳组成。囊膜位于病毒最外层，是来源于宿主的细胞内膜（高尔基体膜或粗面内质网膜)》IBV核衣壳呈螺旋对称，由正链基因组RNA和核衣壳蛋白组成。将鸡胚培养获得的含病毒尿囊液置4°C18小时，负染后在电镜下观察，可着到病逛纤突大量脱落，通过造影可以看到从自然破裂的病毒粒子释放的核蛋白结构(RNP)，多数情况下只能看到直径l-2nm的链状RNP,偶尔也会见到直径10-15nm的环形结构。
2材料与方法
2. 1试验材料
IBVBeaudette株，由本实验室保存。ffiVM41毒株，由东北农业大学传染病教研室魏萍老师惠赠。含传染性支气管炎病毒弱毒H120株103_5EID5()/羽份，购自哈药集团生物疫苗有限公司。
2.1.2试验
动物雄性一日龄雏鸡200只，购买于哈尔滨某鸡场。
2. 1. 3载体、质粒、细胞株及菌株
pVAX真核表达载体由本实验室保存；PCDNA3.1-IBV S和pET-30a-IBV M基因质粒由动物医学学院李广兴教授惠赠;Vero细胞和BHK细胞、感受态大肠杆菌菌株JM109、Rosetta。
2.1.4主要抗体、工具酶及分子生物学试剂盒
FITC标记山羊抗兔IgG、HRP标记兔抗鸡IgG;兔抗IBV全病毒多抗、兔抗IBVS1蛋白多抗，兔抗ffiVM蛋白多抗，小鼠抗鸡CD8+T细胞（FITC)及CD4+T细胞（FITC)单克隆抗体由动物医学学院李广兴教授惠赠；Tag DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Sal I、EcoR I限制性内切酶；小剂量质粒提取试剂盒、DNA Marker DL2000购自TaKaRa生物试剂公司；DNA胶回收纯化试剂盒购自百泰克生物技术有限公司。2.1.5主要的生化试剂脂多糖（Lipopolysaccharides From Escherichia coli 055 ： B5 ； LPS )、刀豆蛋白 A(ConcanavalinA，Con A )、四甲基偶氮唑盐（3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂均购自Sigma试剂公司。Tris、二甲基亚砜（Dimethyl soulfoxide，DMSO)、EDTA 购自 Amresco 公司；胎牛血清购自元亨金马生物技术开发有限公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；RPMI Medium 1640、DMEM 细胞培养液、G418 购自 GIBCO 公司。PEG8000、NaCK LiCK MgC^、琼脂粉、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、异丙醇、丙酮、冰乙酸、三氯甲院、乙醇、磷酸二氢钠等生化试剂均为国产分析纯。
2. 1.6主要实验仪器设备
PCR 扩增仪（GENE AMP PCR SYSTEM 2400，PERKIN-ELMER 公司）；Real time PGR扩增仪（ROTOR GENE 3000，QIAGEN公司）；高速冷冻离心机（J2-21 M,美国Sigma公司）；流式细胞仪（美国BECKMEN COULTER公司）；炎光显微镜（日本Nikon公司）；二氧化碳培养箱（力康公司）；紫外分光光度仪（3000，PHARMACIA BIOTECH公司）；凝胶成像仪⑴VP-800, UITRA-VIOLET PRODUCTS LIMITED CAMBRIDGE UK)；；图片采集系统软件LEICA APPLICATION SUITE (德国LE丨CA公司）；空气浴振荡器（HZQ-C，哈尔滨东联电子有限公司）；水平电泳槽、电泳仪（DYYIIM1，北京六一仪器厂）。
3 试验结果......... 30-51
3.1 IBV M基因、IBV S1-M融合基因的亚克隆........ 30-34
3.3 雏鸡外周血及免疫器官T、B淋巴细胞增殖........ 36-44
3.3.1 雏鸡血液T淋巴细胞增殖的动态变化 ........36-37
3.3.2 雏鸡血液B淋巴细胞增殖的动态变化........ 37-39
3.3.3 雏鸡胸腺T淋巴细胞增殖的动态变化........39-40
3.3.4 雏鸡胸腺B淋巴细胞增殖的动态变化........40-41
3.3.5 雏鸡脾脏T淋巴细胞增殖的动态变化........ 41-43
3.3.6 雏鸡脾脏B淋巴细胞增殖的动态变化........ 43-44
3.4 雏鸡外周血及免疫器官CD4+、CD8+T淋巴........ 44-48
3.5 雏鸡外周血抗IBV抗体含量动态变化........ 48-49
3.6 中和抗体........ 49
3.7 保护率计算结果 ........49-51
4 讨论........ 51-58
4.1 真核重组质粒的构建以及免疫设计........ 51
4.2 真核表达载体以及融合蛋白的选择........ 51-52
4.3 融合基因真核表达载体体外瞬........ 52-53
4.4 雏鸡进行核酸免疫的讨论与分析........ 53
4.5 雏鸡免疫后淋巴细胞增殖功能变化........ 53-55
4.6 雏鸡免疫后不同亚型T细胞动态变化........ 55-56
4.7 外周血液抗IBV IgG抗体含量动态变化........ 56-57
4.8 病毒攻击试验雏鸡后保护率计算结果........ 57
4.9 免疫效果比较分析........ 57-58
结论
1.构建了鸡传染性支气管炎病毒S1基因M基因的融合基因质粒pVAX-IBVSI-linker-M0
2.融合的IBV SI和M基因基因能够在体外表达。
3. IBV S1和M基因疫苗联合免疫后的雏鸡能够抵抗IBV的感染。
4. IBV S1和M基因联合免疫比单独IBV M基因更早诱导机体产生细胞免疫及体液免疫应答，并具有更好的免疫保护效果。
参考文献
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