第一部分中国两头乌猪毛色主效基因五因果突变的鉴别及其遗传效应分析
第一章文献综述
猪是继狗之后的人类驯化的第二个家养动物，在距今约1万多年前的新石器时代前期，人类驯化了野猪，圈养使其成为人类的一种食物储备。在长期的人工和自然选择过程中形成了众多的品种和丰富的表型变异。每个品种具有自身独特的种质特性，而毛色是猪重要的品种特征之一。值得一提的是，毛色是哺乳动物中第一个用于遗传学分析的表型性状⑴，它的研究可追溯至20世纪前叶。Sprnman 1906年首次提出西方猪的白毛属于显性遗传[2]，1945-1954年，Hetzer接连发表了 9篇关于猪的毛色遗传文章[3-11]，但受当时研究条件所限，猪毛色遗传的分子机理尚无法展开。二十世纪90年代以来，随着猪基因组学和分子生物学技术的不断发展，毛色的分子遗传学研究取得了突破性进展，显性白毛、显性黑毛、棕褐毛色及花斑色的调控基因相继得到鉴别，大大丰富了人们对哺乳动物色素沉积机理的认识，同时为猪的品种纯度鉴定和亲缘关系分析提供了新型的手段。
1家猪毛色的类型
猪的毛色主要有如下几种类型（如图1-1-1):
1.1野生型
野生型毛色是指野猪的毛色类型，皮肤呈灰色，被毛为棕褐色或黑色。野猪的幼仔为淡黄褐色的条带状毛色，一般称为“保幼条带”，随着年龄的增长，条带渐渐消失而成为成年野猪的棕褐色或黑色的毛色类型。有些家养的猪种也具有这种特征，如藏猪、少数的杜洛克及曼格里察猪（Mangalitza)等。一些猪的后代也会出现低频率的纵向条纹，如加勒比海的Creole猪及红色、黑色、白色猪的杂种和合成系猪。
1.2白色
被毛完全为白色，但根据其皮肤的颜色分为两种类型：一种为皮肤底色为白色，毛色也为白色，如大白猪（约克夏)、长白猪（兰德瑞斯）、切斯特白等猪种；另一种是皮肤底色为除白色的其他颜色，但毛色为白色，如产自匈牙利和澳大利亚的古老猪种曼格里察猪（Mangalitza)。
1.3全黑色
全身皮肤和被毛均为黑色。全黑色的猪在我国有许多，例如槐猪、二花脸、民猪、明光小耳猪、内江黑猪、汉江黑猪等。国外也有不少全黑型猪，例如英国大黑猪等、德国的Gomwall、法国的Gascon等。
1.4红色
全身均为棕红色或金黄色。典型的的猪种有美国的杜洛克，美国其他的猪种如明尼苏达1号、泰姆华斯等，部分曼格里察猪（Msangalitza)和利比里亚猪（Iberian)以及源于利比里亚的美洲当地品种的毛色也为红色。
1.5棕褐色
毛色呈现棕褐色，棕褐色的程度深浅不一。分布于我国云南富源的大河猪、贵州赫章的可乐猪及少数的藏猪都是属于这种类型的猪，其毛色呈现由浅到深的变化现象，当地俗称“火毛猪”。
1.6白环带
这种毛色类型可以分为两种，一种为除头部和尾部其余都为白色的两头乌猪，例如我国的金华两头乌、巴马香、沙子岭、通城以及剑白香等。而另外一种则主要表现颈间部为白色，躯体两端为黑色。例如我国的宁乡猪、陆川猪和美国的汉普夏等都为这种毛色类型的猪。
2哺乳动物毛色形成的生理学基础
毛色形成与黑色素有关，黑色素（melanin)的数量、大小、种类组成和分布情况决定了毛色的类型。一般情况下，黑色素细胞的数量和大小是恒定的，所以毛色主要取决于黑色素细胞的组成和分布情况。黑色素主要有两类：一类为褐黑素(phaeomelanin)(红/黄），另一类为真黑素（eumelanin)棕/黑），两者不同的比例组成形成不同的毛色颜色[12]。在形成毛色的过程中有三个关键的阶段：第一阶段是色素细胞的发育阶段；第二个阶段为黑色素形成阶段；第三个阶段是黑色素的迁移沉积过程。这三个阶段决定了毛色的最后呈现类型。因此，了解黑色素细胞的起源、结构、分化及黑色素的形成、转化及调控机制有助于深入理解猪毛色遗传的生化机理。
2.1黑色素细胞的起源
黑色素细胞主要分布于皮肤的表皮基层和毛球部位，它产生黑色素并把黑色素分泌到邻近的角蛋白细胞中。哺乳动物黑色素细胞起源于神经嵴，在胚胎发育过程中通过间充质逐渐迁移到表皮部位。神经嵴干细胞具有多向分化的潜能，在生长因子的诱导作用下，可增殖并分化为皮肤、内耳、眼虹膜及脉络膜中的黑色素细胞。黑色素细胞前体，即成黑色素细胞（Melanoblast)在胚胎发育过程中从神经管背侧迁出，通过不同的路径迁移到皮肤、内耳、眼虹膜及脉络膜的表皮毛囊中，分化成成熟的黑色素细胞（Melanocytes) (图1-1-2)。成黑素细胞在最后发育中分离为两类细胞，一种是在毛发的发根基底分化成成熟的黑素细胞，另一种是在公认的膨大区域分化成限制在休眠状态的黑素干细胞。在电子显微镜下，黑色素细胞的基本单位为单细胞腺体，其微细结构类似于分泌细胞，圆形的细胞结构，长有不规则的突起。鉴于此，黑色素细胞又称为树枝状细胞。在其圆形细胞内含有许多线粒体、内质网和高尔基体等细胞器，而不同发育阶段的黑色素颗粒小体则分布在树枝突上，利用一些酶学反应形成成熟的黑色素，通过树枝突伸展到表皮细胞之间[15](图1-1-3)。
第二章 正文........ 24-45
1 引言........ 24
2 材料与方法........ 24-30
2.1 实验动物........ 24-28
2.2 EDNRB基因的重测序........ 28
2.3 EDNRB基因因果突变位点的鉴别........ 28-29
2.4 EDNRB基因标签突变位点的检测........ 29-30
2.5 生物信息学分析........ 30
3 结果与讨论 ........30-44
3.1 EDNRB基因组重测序及SNP的搜寻........ 30-38
3.2 两头乌猪共享IBD区域的发现 ........38-40
3.3 EDNRB基因候选因果SNP的鉴别........40-42
3.4 中西方种猪在EDNRB标签位点的遗传........ 42-44
4 小结........ 44-45
参考文献........ 45-52
结论
本研究检测了 5个野猪和中国11个地方猪及西方3个商业猪种的307个个体在MUC4基因区域53个SNP标记的基因型。在这些猪种中对MUC4基因开展了核苷酸变异、单倍型分析和连锁不平衡程度等分析。中国和西方猪种在MUC4的位点中都含有相当大的核苷酸变异。西方猪种的核苷酸变异程度与中国地方猪种相当，并没有因对于瘦肉含量的人工选择而减少MUC4的遗传变异。单倍型进化分析显示MUC4在中国和西方猪种的进化历程截然不同。品种间的遗传分化树状图总体与这些品种的进化历史和地理分布情况一致。中国和西方品种的MUC4连锁不平衡模式相似，都小于20 kb的距离，这不同于之前在西方商业猪种中LD程度高（大于lOOkb)的报道，反映了猪基因组核苷酸变异的复杂性，提示需要高密度的标记（例如1 SNP/10kb)高效定位位于像MUC4区域的因果变异位点。Tajima's D或Fu and Li's D统计值在一些中国和西方猪种中显著的正值提示可能经过平衡选择。不过，这样的结果也可能是由于SNP的筛选偏差所致。
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