第一章 欧洲型、美洲型 PRRSV ORF3、ORF5 基因及 PCV2 ORF2基因的克隆与序列分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在北美和欧洲同时爆发，并形成持续性威胁，引起了包括中国在内的世界各国养猪业的重大经济问题。PRRSV 属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，是猪复杂的呼吸系统疾病的主要病原，发病特征表现为断奶乳猪生长缓慢，食欲下降，厌食，发热，咳嗽，以及呼吸困难，成年猪的特征为繁殖障碍。PRRSV 通常分为两种基因型，欧洲型和北美型。两种基因型在临床，抗原性，基因方面都具有异构性。虽然PRRSV的异构性是显而易见的，但人们尚不清楚进化过程中怎样形成异构的。此外，世界上的许多地区包括中国，都证明了两种基因型可以共存，并且两中基因之间很少有交叉保护作用。除此之外，中国的改良型活疫苗病毒和局部变异的重组现象，使得疫苗应用或疾病加强管理控制策略增加了难度，而且，如果这一地理区域内有其他并发疾病，如猪圆环，伪狂犬，猪瘟，猪流行性腹泻等，都有可能增加蓝耳病在我国的感染程度。
猪圆环病毒（PCV）为无囊膜的单股环状DNA病毒，1998年首次分离到，并迅速蔓延到全世界的养猪业中。主要分为 PCV-1 和 PCV-2 两个血清型，能引起猪发病的主要是PCV2病毒。PCV2感染除了造成猪断奶后多系统衰弱综合征（PMWS），同时还与猪肠道疾病、猪呼吸道综合症（PRDC）、猪皮炎和肾病综合征（PNDS）、先天性仔猪震颤、繁殖障碍、胎儿心肌炎和扩张性坏死性肺炎等猪圆环病毒病（PCVAD）密切相关，本病被世界各国公认为是继猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）之后新发现的重要的猪传染病。
本研究以欧洲型PRRSV LV株、美洲型PRRSV CC株及PCV2 NM株为基础，分析其基因组序列特征，分别克隆了欧洲型、美洲型PRRSV ORF3、ORF5基因及PCV2 ORF2基因。为进一步研究欧洲型、美洲型PRRSV ORF3、ORF5基因及PCV2 ORF2基因的功能奠定了基础，为下一步基因工程疫苗的设计提供了依据。
1 材料
1.1 毒株与细胞
Marc-145 细胞、PK15 细胞由本实验室保存，基础培养基为含 10%胎牛血清的DMEM, 37℃ 5%的CO2 培养箱中培养。欧洲型 PRRSV LV 病毒株（GenBank登录号：M96262），由大连出入境检验检疫局惠赠。美洲型PRRSV CC株为本实验室从病料中分离、鉴定保存，病毒接种 Marc-145 细胞培养扩毒，用Reed-Muench 法测定其 TCID50，分装保存于?80℃备用。PCV2 NM 株为本实验室分离、鉴定保存。
1.2 主要试剂
基因组DNA和质粒小量提取试剂盒均为为AXYGEN公司产品；经典总RNA提取试剂盒为上海生物工程公司产品；PrimeScript? RT 反转录试剂盒为TAKARA公司产品；胎牛血清（Fetal bovine serum，FCS）、胰蛋白酶酶和DMEM培养基均为Hyclone公司产品；其它试验用生化试剂均为分析纯级。
第二章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究
控制和预防猪繁殖呼吸综合征（PRRSV）最主要的方法是免疫接种。目前，世界上许多地区都有一系列的 PRRSV 疫苗产品。然而，自从 1994 年美国开发了一种弱毒活疫苗之后，尽管人们做了大量的工作，但在提高疫苗功效方面收效甚微。关键的限制因素包括：（a）保护性免疫病毒靶位的不确定性，阻碍了关于病毒结构和病毒蛋白的研究，并使得设计新型疫苗困难重重；（b）不能建立清晰的免疫保护间的相互关系，要实现这一目标，需要对攻毒模型进行大量的体内研究来评估抗攻毒保护作用；（c）由于不能够预测免疫性保护是如何针对单一病毒分离株发挥作用的，而且，PRRSV 的遗传多样性能够导致了的交叉保护性免疫低下，因此，我们需要谨慎地执行攻毒实验。许多野生型分离株具有显著水平的交叉保护作用，但这并不能保证自然界中存在的分离株就具有有效的保护作用。在PRRSV疫苗的发展中，除了这些实质性的障碍之外，我们在理解猪免疫学机制和过程中还存在大量的空白，而正是这种未知的免疫机制和程序可能为PRRSV 感染提供了免疫，也可能给长期感染提供了记忆应答。尽管存在这些困难，但是我们依然相信会取得进步。猪的基因组测序工作给我们在基因结构和转录调节的基础知识方面提供丰富的资源，并肯定会进一步揭示抗PRRSV免疫机制。而且许多科研工作者正在为解开PRRSV 与猪之间的相互作用的细节而不懈努力，最终也会产生能够解决该领域中现有不足的新的理论和认识。
DNA 疫苗与传统疫苗相比，具有一些显著的特点：他们很容易生产，价格相对廉价的，均匀，热稳定，并被认为比亚单位或病毒载体为基础的疫苗更安全。在过去的十多年中，众多的DNA疫苗已被构建和测试功效。一些令人欣慰的结果已有报道，然而，很明显，疫苗的免疫原性还有待提高。选择合适的佐剂和递送系统可以增强DNA诱发的免疫反应。传统上，铝盐或弗氏佐剂类型是唯一可用的方法，以增加疫苗引起的反应。但是，现在分子生物学和基因重组技术的进步，允许各种细胞因子以及免疫调节分子的应用在DNA疫苗制剂中[255]。新一代常规佐剂也已开发，并显示有希望提高DNA引起的免疫力。另外，接种途径，包括肌肉，皮下，鼻内，基因枪或粉末喷射给药，也将潜在影响DNA免疫的效果。
本次实验将在实验一的基础上构建欧洲型、美洲型PRRSV二价核酸疫苗，以 Quil A 为佐剂，壳聚糖纳米粒递送方式，免疫小鼠，检测其各项免疫数据，分析所构建核酸疫苗的初步免疫效果。
1 材料
1.1 毒株、细胞及质粒
Lelystad （LV）株病毒由大连出入境检疫局惠赠，高致病性 PRRSV（HP-PRRSV）NM12株由本实验室从病料中分离、鉴定保存。病毒培养为基础培养基为含10%胎牛血清的DMEM, 37℃ 5%的CO2 培养箱中培养。用 Marc-145细胞来培养扩毒，Reed-Muench法测定其TCID50，分装保存于80℃备用。BHK-21细胞由本实验室保存。pMD18-T-EU-ORF3、pMD18-T-EU-ORF5、pMD18-T-NA- ORF3、pMD18-T-NA-ORF5、pMD18-T-PCV-ORF2 重组质粒由第一章获得。
1.2 主要试剂
T4连接酶等各种限制性内切酶等，均购自 TaKaRa 大连生物工程公司；RPMI1640 培养基为 Hyclone 公司产品产品；FITC 标记的山羊抗猪 IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠 IgG 均为博奥森公司产品；X-tremeGENE DNA 转染试剂为 Roche Applied Science 公司产品；美洲型、欧洲型 PRRSV GP3 和 GP5 多克隆抗体由本实验室制备；PE anti-mouse CD8a，PE/Cy5 anti-mouse CD3ε，FITC anti-mouse CD4均为BioLegend 公司产品；壳聚糖购自美国 Sigma-Aldrich 公司；Quil A 佐剂为美国Accurate Chemical & Scientific Corporation 产品；小鼠血清 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ ELISA 检测试剂盒（ELISA Ready-SET-Go!?）为 eBioscience 公司产品；小鼠淋巴细胞分离液为为天津灏洋公司产品；WST-1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒为碧云天生物技术研究所产品；刀豆蛋白 A （ConA）为Sigma 公司产品。
第三章 欧洲型PRRSV及PCV2二联核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究 .............. 63
1 材料 ................ 63
2 方法 ............. 63
3 结果 ............. 65
4 讨论 ....................... 71
5 小结 .............. 73
第四章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗和欧洲型 PRRSV、PCV2 二联核酸疫苗猪体实验免疫研究 ...............75
1 材料 ............ 75
2 方法 ................ 76
3 结果 ............. 79
第五章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价重组痘病毒疫苗和欧洲型PRRSV、PCV2 二联重组痘病毒疫苗的构建及猪体实验免疫研究 ........ 97
1 材料 ................. 97
第五章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价重组痘病毒疫苗和欧洲型PRRSV、PCV2 二联重组痘病毒疫苗的构建及猪体实验免疫研究
所有的疫苗必须具备良好的安全性和免疫原性。特别是，能够诱导产生合适的免疫免疫反应类型，介导较长的免疫期限。更重要的是，新型的疫苗大规模生产必须严格符合法规。病毒疫苗的发展有多个类型，主要有：亚单位疫苗，它由混合可溶性抗原的佐剂组成，其中有些佐剂是脂质体。（脂质体和病毒颗粒样疫苗）；灭活疫苗，通常使用化学物质，例如福尔马林和 β-甲醛，灭活疫苗主要是灭活病毒，而不是摧毁病毒囊膜蛋白的抗原性；活病毒疫苗，包括非病原性形式的病毒。
灭活疫苗生产低廉但免疫原性较差，只能提供短期的免疫保护力。脂质体佐剂疫苗能够介导较长的免疫保护期限，但价格贵。相比较而言，弱病毒疫苗效果好而且能提供较长的保护力，但是其安全性还需考虑，可以用于常规的先天性免疫计划。弱毒疫苗可以进行大规模的生产，但是大剂量的免疫注射会导致疫苗的生产费用增高。使用病毒作为载体作为基因传递工具，近年来得到了很大的发展，可以用不同的 DNA 和 RNA 病毒作为基因传递载体设计多样性的疫苗。痘病毒是双链DNA病毒，基因组大小为150-300kb。DNA的复制发生在细胞核，第一个重组病毒载体疫苗就是利用痘苗病毒作为载体。痘病毒载体能够很容易进行基因手段操作，产生较高的病毒滴度，具有较好的稳定性，同时具有较高的安全性，并能保持或提高病毒载体的复制性，这些优点已经得到很多同行的肯定。
结 论
1. 欧洲型、美洲型 PRRSV GP3 和 GP5 蛋白及 PCV2 ORF2 编码蛋白具有较好的免疫原性，能有效的诱导小鼠体液和细胞免疫反应。通过小鼠及猪体实验证明欧洲型PRRSV GP3蛋白具有增强GP5蛋白免疫原性作用，二者协同作用效果最佳。
2. 欧洲型 PRRSV、PCV2 二联核酸疫苗 pVAX-ORF2-EU-ORF3-ORF5 可以诱导猪体特异性中和抗体和淋巴细胞产生，能有效的抵抗 LV株病毒的感染；欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗 pVAX-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5 在NM12 株病毒攻毒后，CD8+T 淋巴细胞的增殖水平高于美洲型弱毒疫苗免疫组14%，血液中病毒载量低于美洲型弱毒疫苗组 7%；在欧洲型 LV 株病毒攻毒后，血液中病毒载量显著的低于空载体对照组 51%。表明二价核酸疫苗在欧洲型 LV株和高致病性PRRSV NM12株的攻毒下，能够显著的降低猪体病毒血症的症状，抵抗病毒在组织器官中的感染复制，提供有效的交叉保护效率。
3. Quil A 可以增强 DNA 疫苗的免疫效果，增强核酸疫苗的免疫应答，以 Quil A 为免疫佐剂，DNA-壳聚糖纳米粒的递送方式进行核酸疫苗免疫，是一种较佳的DNA免疫策略。
4. 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价重组痘病毒疫苗 rVV-NA-ORF3-ORF5 -EU-ORF3-ORF5 和欧洲型 PRRSV、PCV2 二联重组痘病毒疫苗 rVV-ORF2- EU-ORF3-ORF5 能够有效的诱导猪体产生特异性免疫应答，其中二联重组痘病毒疫苗 rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5 最高中和抗体效价高于灭活苗免疫组 25%；CD4+和CD8+的水平攻毒后分别高于灭活苗免疫组19%、21%，并显著的高于野毒对照组；二价重组痘病毒疫苗 rVV-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5 攻毒后CD4+和 CD8+的水平分别高于弱毒疫苗免疫组 11%、8%，其中脾脏、肾脏、肝脏中的病毒载量分别低于弱毒疫苗组 15%、7%、26%。结果表明二价和二联重组痘病毒疫苗在病毒感染时，能够明显的减少病毒血症的症状，同时各组织器官中病毒载量也显著低于野毒对照组。
参考文献（略）