第 1 章 实验研究
1.1 材料与方法
1.1.1 研究对象及材料
1）实验对象为 18 只 SPF 级体态活泼的 SD 大鼠，均为雄性个体，体重在 180-200 g 间，来自华北理工大学实验动物中心。将实验大鼠饲养于干净通风室内，提供适宜的洁净水和饲料，对鼠笼定期进行清理，避免污染发生；
2）煤矿粉尘取自邯郸煤矿开拓区；
3）购买 500 g 二氧化硅粉尘（美国 Sigma 公司）。
1.1.2 试剂与仪器
1）试剂
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1.2 结果
1.2.1 大鼠一般情况
随着染尘时间的延长，与对照组相比，煤矿粉尘组和二氧化硅组的大鼠毛色暗淡、无光泽，且伴有活动量显著降低的情况，反应略有迟钝，同时大鼠具有咳嗽、呼吸加重的症状，然而日常饮水无异常情况。由表 5 可见，染尘 24 周后，二氧化硅组大鼠的体重明显低于对照组和煤矿粉尘组。
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染尘 24 周后，制作大鼠 HE 病理切片可见（图 1），煤矿粉尘组肺组织构造严重被破坏，而且有大量炎症反应出现，伴有许多成纤维细胞聚集情况出现，从而形成细胞结节；二氧化硅组的肺泡构造也有一定程度的破坏，且炎症反应加重，可见明显矽结节；对照组肺组织构造正常，具有少量炎症反应。
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第 2 章 综述 呼吸道菌群与代谢组学在呼吸系统疾病中的研究进展
2.1 呼吸道菌群研究
目前，微生物在健康和疾病中的作用越来越受到重视。随着微生物组学研究的深入，其在局部和远端的生物学功能已被认识。正常人中，其体表和与体外相连的体腔中，存在着种类与数量不同的微生物。在大多数情况下，人体能与这些不同的微生物共存，称其为共生微生物群或正常微生物群。因为它们主要是细菌，所以也被称为共生微生物群或菌群。结合细菌在人体内的分布状况，微生态系统又可划分为五大系统，为口腔系统、皮肤系统、呼吸道系统、胃肠道系统与泌尿生殖道系统，它们对维持人体健康起着重要作用。它们从生长发育、营养吸收、消化、脂肪代谢、药物代谢、能量供应、免疫调节等多个方面影响人体健康。正常情况下，这些微生物与宿主和睦相处，相互适应，各种微生物也相互制约，保持共存状态。
呼吸道是肺部呼吸时空气流过的通道。解剖气道以环状软骨下缘为界，有上、下两种气道之分。在上呼吸道中，鼻子、鼻窦和喉咙是其组成部分。在下呼吸道中，主要由气管到终末细支气管的整个支气管树构成。沿鼻腔、鼻咽、口咽、气管和肺，pH、CO2 压力、相对湿度和温度逐渐升高，O2 分压降低。由于它是一个与外界连通的空腔，经常受到外界微生物的侵袭，因此具有很强的局部免疫力。呼吸道长期以来被认为是无菌的。其实，人类呼吸道从鼻孔到肺泡，每个特定的部位都存在着细菌群落。在不同细菌中，经群体感应体系与局部分泌的抗微生物多肽，在外界因素的影响下，不断演替以维持呼吸系统微生态的动态平衡，与人体和平共处，实现共生。然而，受外界多种因素作用，呼吸道局部的免疫功能出现紊乱，很可能会导致人体发生哮喘、慢性阻塞性肺病（Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）、肺囊性纤维化和上呼吸道咳嗽综合征等多种呼吸道急慢性疾病[58]。随着技术的发展，越来越多研究显示，肺部存在微生物群落，并且这些微生物群落与多种肺部疾病相关[59-63]。最近，肺微生物也被认为是导致肺部疾病的原因，其变化将影响疾病的发生、应答性药物和临床结局[64]。
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2.2 代谢组学研究
代谢组学是在蛋白质组学和基因组学基础上发展起来的新兴组学技术。其概念是被 Nicholson 教授[104]首次提出的。代谢组学在疾病的早期诊断和发病机制中起着重要作用。它是系统生物学的重要组成部分。其初衷是通过多元统计分析了解生命体在不同病理生理刺激下的代谢变化。同时也是为了尽可能多的以内源性代谢产物来更全面的分析其在人体内的变化。然而，在体内鉴定了大量内源性代谢产物及相关代谢途径后，往往需要确定具有相似结构或生化功能的特定代谢产物，以实现对生理生化机制的准确定位、疾病的预测和分类。
现今，代谢组学技术也已被应用到许多呼吸系统疾病的研究中。通过 GC-MS 技术对气阴两虚型、肺脾气虚型哮喘儿童及正常儿童的尿液样本进行分析，苟小军[108]等共鉴定出 17 个差异代谢物，并发现代谢物相对含量有明显差异的为肌酐、丁酸、甘氨酸等，提示可能与体内氨基酸代谢、核苷酸代谢和能量代谢异常相关。Conlon等[109]使用基于 MS 的方法收集了在肺气肿进行期间病人的肺组织、BALF 和血清，并对其进行代谢组学分析，第一次证明了肺特异性左旋肉碱的减少可能影响肺气肿的进展。采用气相和液相色谱与质谱联用的方法，Laguna 等[110]在肺部恶化期和住院期 CF 病人的血浆中，共鉴定出 5 种可能与疾病恶化的病生理机制有关的代谢物。钱文娟等[111]应用气相色谱-质谱联用技术，在患有甲型 H1N1 流感病毒性肺炎的小鼠肺组织中，筛选出 14 种可作为 H1N1 流感病毒性肺炎潜在生物标志的代谢物，且涉及的代谢途径主要有糖代谢、甲硫氨酸代谢以及嘌呤代谢。同时有研究发现，尘肺病人肺功能损伤，反复出现感染，影响了机体的内分泌，引发钙磷代谢紊乱和胃肠道吸收功能降低，从而诱导了血清中的 25-羟维生素 D 降低[112]。
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第 2 章 综述 .......................... 40
呼吸道菌群与代谢组学在呼吸系统疾病中的研究进展 ...................... 40
2.1 呼吸道菌群研究 ................................. 40
2.2 代谢组学研究 ................................ 43
2.2 问题与展望 ............................................ 44
问题与展望
肺脏是人体重要的呼吸和免疫器官，其内部存在着众多的微生物菌群，而这些微生物对宿主的健康或疾病有着重要的作用。研究发现，呼吸道菌群与许多呼吸系统疾病有关，且可影响宿主的代谢表型。而我们的研究证明，尘肺病作为一种慢性呼吸道疾病，其也受呼吸道菌群及代谢功能的影响。然而由于呼吸道菌群本身量级较小、不容易被富集，且肺脏是一种开放性器官，使其受环境影响较大，再加上机体自身的影响，以及临床样本获取难度大等问题，导致呼吸道菌群研究相比肠道菌群研究更加困难，难以找出具体是哪些菌群的减少或增加引起了疾病的发生，也更难明确出单一的危险因素。因此，需要进行更多且更深的研究来对其进一步加以确定。
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结论
本研究综合运用 16SrDNA 基因测序技术和 UHPLC-Q-TOF-MS 代谢组学方法，对尘肺模型大鼠的呼吸道菌群和肺灌洗液代谢情况进行检测分析，最终得出以下结论：
1）暴露在粉尘中，机体呼吸道菌群及代谢状况发生紊乱。
2）粉尘暴露后，上呼吸道中，煤矿粉尘组大鼠穆里氏菌属、Muribacter_muris、未培养的寡养单胞菌属丰度升高，巴斯德氏菌属、Bacteria、罗氏杆菌属、未培养的罗氏杆菌属丰度降低；二氧化硅组大鼠巴斯德氏菌属、无乳的链球菌属丰度降低。下呼吸道中，煤矿粉尘组大鼠 Bacteria 丰度升高，支原体属、γ-变形菌纲、β-变形菌目、伯克氏菌科丰度降低；二氧化硅组大鼠双歧杆菌目、双歧杆菌科、Bacteria 丰度升高，β-变形菌目、伯克氏菌科丰度降低。
3）经肺灌洗液代谢组学分析鉴定：泛酸、硬脂酸等 5 个差异代谢物可能成为煤矿粉尘组大鼠的潜在代谢标志物，其主要参与的代谢通路为不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸生物合成；L-谷氨酸、尿嘧啶、胞苷、尿苷等 18 个差异代谢物可能成为二氧化硅组大鼠的潜在代谢标志物，主要涉及的代谢通路中嘧啶代谢、D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢可能是尘肺发生发展过程中的关键代谢通路。
4）β-变形菌目、伯克氏菌科、双歧杆菌目、双歧杆菌科、无乳的链球菌属失调，可能导致嘧啶代谢、D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢发生异常，从而对尘肺病的发生发展产生影响。
本研究虽证明了大鼠尘肺过程中机体微生物菌群和代谢状况会发生改变，并找出了相关的差异菌群和差异代谢物，但也存在一定的问题和不足。比如，本研究的样本量相对较少，也未对实验动物进行动态监测；同时，本研究只是一种观察性的研究，并未对筛选出的差异菌群和代谢物进行进一步的研究。因此，需要在未来的研究过程中，在扩大样本量的基础上，对差异性菌群和代谢物进行如宏基因组学、靶向代谢组学等研究，进一步分析其功能，并结合临床人群实验数据，来进行更为深入的研究。
参考文献（略）