本文是一篇药学论文，本论文对阿莫西林-舒巴坦杂合分子在大鼠体内的代谢进行了研究，考察了其在大鼠体内的急性毒性试验，结果表明杂合分子在大鼠体内主要以前体药物阿莫西林和舒巴坦原型从尿液中排出，阿莫西林的进一步代谢产物为阿莫西林二酮哌嗪和阿莫西林酸。
1 前言
1.1 阿莫西林研究进展
1.1.1 阿莫西林概述
阿莫西林（Amoxicillin，AMO），白色或类白色结晶性粉末，稍带特异气味，味苦，微溶于水，在乙醇中几乎不溶，在胃酸中较稳定。1968年由比撤姆（Beecham）公司开发的一款半合成、广谱β-内酰胺类抗生素，属第二代青霉素类药物。阿莫西林的抗菌谱广，毒性小，是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐首选的β-内酰胺类口服抗生素；阿莫西林又名羟氨苄青霉素，是在氨苄西林的侧链上引入羟基而合成，故而结构上阿莫西林比氨苄西林多了一个羟基（de Marco et al., 2017），图1.1分别为两者结构示意图。羟基的引入，使得阿莫西林的耐酸能力增强，亲脂性降低，口服生物利用度得到大幅提升，但抗菌活性和抗菌谱与氨苄西林相同，目前阿莫西林在兽医临床应用广泛且重要（虞正烨等，2020）。
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1.2 舒巴坦研究进展
1.2.1 舒巴坦概述
舒巴坦（Sulbactam）为白色晶体，易溶于水，其分子式为C8H11NO5S，分子量大小为233.24，1978年由Englikh首次报导，属于青霉烷砜类，是一类半合成的不可逆竞争型β-内酰胺酶抑制剂，其结构如图1.2所示，自身抗菌活性偏弱，在临床使用时，较少单独使用，仅对淋球菌和不动杆菌表现出较弱的抗菌作用，而肠球菌属和绿脓杆菌属对舒巴坦耐药。舒巴坦口服吸收差，在组织中分布广泛且能透过血脑屏障和胎盘屏障，蛋白结合率达38%；常以肌肉注射和静脉注射为主，主要以原型药物经肾排泄，故而肾功能减退病人使用此药时要适当减量。
1.2.2 舒巴坦抗菌机制及活性
舒巴坦的抗菌机制是通过不可逆地与β-内酰胺酶结合使其失活发挥抗菌效果。首先与β-内酰胺酶形成酰化物，继而开环形成中间体，再进行重排后得到β-氨丙烯酸类化合物且不易被水解，中间体和不易水解的β-氨丙烯酸类化合物还可进一步转化成不可逆失活产物，从而使β-内酰胺酶失活，产生抗菌作用。β-内酰胺酶抑制剂的活性还容易受到细菌外膜的通透性，pH值以及与酶的结合程度影响，其对革兰氏阴性菌外膜穿透性差，对能产生β-内酰胺酶的金黄色葡萄球菌、肠杆菌有抑制作用（张春辉等，2004）。舒巴坦对链球菌和脑膜炎双球菌的抑制作用强，MIC分别为0.11 μg/ml和3.12 μg/ml；对大多细菌MIC值大于25 μg/ml，表现出不敏感作用（何斌，2012）。
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2 材料方法
2.1 材料
2.1.1 药品与试剂
阿莫西林：含量87.00%，批号：130409-201913，中国食品药品检定研究院； 舒巴坦：含量98.54%，批号：DM21022603，广州隽沐生物科技股份有限公司； 阿莫西林二酮哌嗪：含量93.68%，批号：DM20051896，广州隽沐生物科技股份有限公司； 阿莫西林酸：含量99.18%，批号A634265，Toronto Research Chemicals； 阿莫西林-舒巴坦杂合分子：含量93.00%，本实验室合成（杂合分子由阿莫西林与舒巴坦以摩尔比1:1合成）； 乙腈，甲醇，甲酸，色谱级，美国赛默飞公司。
2.1.2 试验仪器及材料
超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪：UPLC1290-6540B Q-TOF，1290超高压液相色谱系统；6540B Q-TOF四极杆串联飞行时间质谱系统，配置有AJSESI和APCI源，Mass Hunter工作站，Metabolites ID软件，安捷伦科技有限公司； 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：UPLC 1290-6470A，配有超高压二元梯度泵，超高效自动进样器，超高效柱温箱，三重串联四极杆质谱仪，安捷伦科技有限公司； 超高效液相色谱仪：Waters UPLC（I-Class）型，配有PDA检测器，美国Waters公司； 电喷雾-三重四极杆质谱仪：Waters Xevo TQ-S Micro型，配有配备Xtended Dynamic Range（XDR）检测器，ESI离子源，IntelliStart软件，美国Waters公司； 超纯水系统：Academic A10型，美国Millipore公司； 超声仪：KA-500 DB型，昆山禾创超声仪器有限公司； 迷你混合仪：MIX-2500普通型，杭州佑宁仪器有限公司；
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2.2 阿莫西林-舒巴坦杂合分子在大鼠体内代谢研究
2.2.1 动物试验
实验动物：SD雌性大鼠，SPF级，体重为180 g～220 g，许可证为SCXK(辽)2020-0001。
样品收集：将12只大鼠适应性喂养7天，试验前12 h禁食，自由饮水。随机分为2组，每组6只。分别为空白组（A组），采样组（B组），B组以100 mg/kg b.w. 剂量灌服给药（A组给予相同剂量生理盐水），给药后0.5 h采集血液、肝脏、肾脏、尿液、粪便，迅速将血液样品加肝素钠后于4℃，4000 r/min离心10min后分离得到血浆，所得样品置于-20℃保存。
2.2.2 样品前处理
血浆、尿液：准确吸取200 μL样品于1.5 mL离心管中，加入800 μL乙腈，充分涡旋2 min，超声提取5 min。4℃，10000 r/min离心10 min，取上清液于2 ml离心管中，40℃氮气吹干。用200 μL 30%乙腈水复溶，充分涡旋2 min，超声提取5 min，10000 r/min，离心10 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，进行UPLC-Q-TOF MS检测。
粪便、肝脏和肾脏：分别准确称取1 g样品于10 mL 离心管中，加入3 mL乙腈，充分涡旋1 min，超声5 min，充分振荡5 min，置于离心机中，4℃，10000 r/min，离心10 min；取上清液于5 mL的离心管中，40℃氮气吹干；加入1 mL超纯水溶解，再加入3 mL的二氯甲烷充分涡旋1 min并离心，对Waters HLB固相萃取小柱中先后用3 mL甲醇和超纯水进行活化小柱，将离心得到的上清液吸取至萃取小柱，用1 mL超纯水淋洗，2 mL 95%乙腈水洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干；0.2 mL 30%乙腈水复溶，10000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，进行UPLC-Q-TOF MS检测。
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3.结果 ................................. 20
3.1 体内代谢 .............................. 20
3.1.1 杂合分子、阿莫西林、阿莫西林酸、阿莫西林二酮哌嗪相关谱图 ........................... 20
3.1.2 杂合分子代谢物在各组织中的谱图....................................... 25
4.讨论 ............................. 35
4.1 阿莫西林-舒巴坦-杂合分子的体内代谢研究 .............................. 35
4.2 阿莫西林舒巴坦-杂合分子代谢物定量 ....................................... 40
5.结论 ........................... 42
4. 讨论
4.1 阿莫西林-舒巴坦-杂合分子的体内代谢研究
对代谢物的初步预测，主要从以下两个方面进行，一方面是基于拼合原理，这与舒他西林相同，我们可以看出氨苄西林与阿莫西林结构上只相差一个羟基，所以可根据舒他西林的质谱裂解以及代谢等方面的信息有助于我们对代谢物的初步预测。舒他西林含有双酯结构，有学者用电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱对其裂解规律展开了研究，首先是断裂β-内酰胺环产生m/z 405的碎片离子，该碎片含有舒他西林的双酯键，双酯键进一步断裂会分别得到m/z 160碎片离子和舒巴坦碎片（霍佳丽，2012）。由于阿莫西林-舒巴坦杂合分子亦存在β-内酰胺环，故而预测杂合分子裂解也会产生m/z 405碎片离子，和m/z 160碎片离子及舒巴坦碎片离子，又有研究发现舒他西林的自发水解会以1:1比例释放出氨苄西林和舒巴坦，同时还有产生氨苄西林羟甲酯和舒巴坦羟甲酯，在飞行时间质谱中发现m/z 379.5的碎片离子，提示氨苄西林羟甲酯的出现（胡昌勤等，1997）。故推断阿莫西林-舒巴坦杂合分子可能会产生阿莫西林、舒巴坦、阿莫西林羟甲酯以及舒巴坦羟甲酯，分子量大小分别为365.4 DA、233.2 DA、395.4 DA、263.2 DA。另一方面是从杂合分子本身的质谱裂解图分析其断裂方式，结合前期代谢物的初步预测，经MASS HUNTER软件数据处理，利用分子式查找技术（FBF）获取可能的代谢目标化合物结构信息，再利用分子特征查找技术（MFE）补充其它信息。然后通过ChemDraw软件画出预测代谢物的结构，导入到MSC软件对这些结构进行辅助鉴定。其中在软件中并没有识别出阿莫西林羟甲酯以及舒巴坦羟甲酯结构，但是发现了阿莫西林，舒巴坦和m/z 405碎片离子，以及阿莫西林的代谢产物阿莫西林酸和阿莫西林二酮哌嗪。
药学论文参考
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5. 结论
1、阿莫西林-舒巴坦杂合分子在大鼠体内的代谢研究，发现了阿莫西林、阿莫西林酸、阿莫西林二酮哌嗪和舒巴坦四个代谢产物。
2、尿液中收集的阿莫西林、阿莫西林酸、阿莫西林二酮哌嗪和舒巴坦物质的量占总给药量的摩尔比分别为61.77%、18.08%、1.61%、79.69%，可知阿莫西林-舒巴坦杂合分子在大鼠体内的主要代谢产物为阿莫西林、阿莫西林酸、阿莫西林二酮哌嗪和舒巴坦。
3、急性毒性研究表明，阿莫西林-舒巴坦杂合分子半数致死量大于5000 mg/kg，属于实际无毒，初步得到杂合分子的安全信息，为后期开发研究提供依据。
参考文献（略）