本文是一篇药学论文，本研究主要利用草酸青霉A-1006（Penicillium oxalicum A-1006）发酵培养，对底物DHEA的催化过程进行了研究，完成了副产物的分离纯化及结构鉴定，对副产物峰来源进行了初步研究，尝试了副产物4-AD的几种控制方法，包括酶抑制剂筛选、硫酸二乙酯诱变、常压室温等离子体诱变和紫外诱变，并对紫外诱变获得的突变株Z43生物催化过程中发酵培养基成分、发酵条件进行了优化。
1 绪论
1.1 甾体化合物
1.1.1 甾体化合物的简
甾体化合物是一类具有环戊烷多氢菲核（或称甾核、甾体母核）的化合物，分布较广，其结构与“甾”字相似，底部“田”代表4个稠环，上方“巛”代表3个侧链。甾体母核结构如图1.1所示，A、B、C三环为六元环，D环为五元环，A 环或B环有部分双键，4环处同一均等平面，在母核C13和C10上通常存在角甲基，多为β构型，在C3上通常有酮基(—C=O) 或羟基(—OH)，C17上除酮基、羟基外还常有长短不一的侧链。不同的取代基、双键位置及立体构型造就了不同的甾体化合物，使其存在着不同的生理活性[1]。
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甾体化合物分布广泛，主要包括甾醇类、激素类、胆酸盐、神经甾体、维生素D类等物质，对机体起着重要的调节作用，利用不同甾体化合物具备的不同生理功能，人们开发出了对应的的甾体药物。甾体激素药物可分为下面几种[2, 3]：（1）肾上腺皮质激素，简称皮质激素，包括糖皮质激素和盐皮质激素，如氢化可的松、泼尼松、醛固酮，可调节糖、脂肪、蛋白质及水盐代谢，具有抗炎、抗过敏，治疗风湿性关节炎及阿迪森氏内分泌疾病的作用。（2）性激素，包括孕激素、雌性激素和雄性激素，如黄体酮、雌酮、雌三醇、睾酮，可刺激副性器官的发育和成熟，治疗两性机能不全所致的各种疾病。（3）蛋白同化激素，如苯丙酸诺龙，可降低血胆固醇，促进蛋白质合成，抑制蛋白质异化，并能促进组织新生和肉芽形成等[4]。另有一些开环的甾体化合物活性维生素D类物质，如骨化三醇、阿法骨化醇、帕立骨化醇，在生物体的生命代谢过程中发挥重要作用，可以促进肠道吸收钙磷元素，在骨中增加骨骼更新部位破骨细胞的活性，也可以刺激成骨细胞合成蛋白质，参与骨基质的矿化等[5]。
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1.2 生物催化法制备1α-羟基去氢表雄酮研究
1.2.1 1α-羟基去氢表雄酮的结构和应用
1α-羟基去氢表雄酮（1α-hydroxydehydroepiandrosterone，1α-OH DHEA）又名1α，3β-二羟基-5-雄烯-17-酮，是一种具有一定药理作用的甾体化合物。其化学结构中在1α，3β位置上存在2个羟基，而许多维生素D类药物以及其他许多甾体化合物中也含有1α，3β-二羟基，因此1α-羟基去氢表雄酮可作为维生素D类药物的理想起始原料，同时也是其他甾体化合物的关键性中间体[31]。
1α-羟基去氢表雄酮可应用于马沙骨化醇的合成[32, 33]，后者作为第三代新型的活性维生素D3类物质，可用于甲状腺旁腺功能亢进、银屑病、角化症、跖脓疱病。合成步骤总共7步，具体为1α-羟基去氢表雄酮经叔丁基二甲基氯硅烷（TBSCl）的1,3-位羟基保护，进行wittig反应，通过9-硼双环（3,3,1）-壬烷（9-BBN）引入羟基，羟基烃化后三仲丁基硼氢化锂（L-selectride）开环，再用氮溴代丁二酰亚胺（NBS）溴代、γ-三甲基吡啶（γ-collidine）消除，最后使用四丁基氟化铵（TBAF）脱去硅基保护及光照完成。
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2 1α-羟基去氢表雄酮生物催化过程中副产物的分离纯化
2.1 引言
甾体生物催化即通过微生物酶对甾体底物的特定位点进行修饰获得具备目标生理活性的产物，对象通常为化学合成法难以合成的化合物，如一些特殊位点7α、9α、11α、11β、15α等位点的羟化等。虽然相较化学合成有着更高的选择性和合成效率，且反应条件温和、对环境友好，但仍然因为甾体底物的溶解性较差、全细胞生物催化副产物较多等，导致催化效率偏低，这是实现甾体生物催化技术的工业化的瓶颈。
微生物细胞进行生物催化法制备1α-羟基去氢表雄酮过程也存在这些问题，导致催化效率不高，课题组前期采用菌株草酸青霉A-1006（P.oxalicum A-1006）将去氢表雄酮催化为1α-羟基去氢表雄酮时，由于甾体代谢途径复杂，微生物细胞在催化过程中往往会出现中间代谢产物和副产物，导致1α-羟基去氢表雄酮的转化率只有35%~40%，难以工业化。针对菌株P.oxalicum A-1006生物催化制备1α-羟基去氢表雄酮过程中副产物问题，本章拟考察生物催化过程中主要副产物出现的情况，对副产物进行分离纯化并确定其结构，才能推断其可能来源，为之后进一步探讨副产物出现的原因打下基础。
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2.2 实验材料
2.2.1 菌种
实验菌株为草酸青霉A-1006（Penicillium oxalicum A-1006），由四川抗菌素工业研究所生物催化实验室保存。
2.2.2 培养基
斜面培养基（1L）：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0g、琼脂15.0 g，自然pH。 种子及发酵培养基（1L）：葡萄糖10.0g、玉米浆粉10.0g、硫酸铵2.0g、磷酸二氢钾2.0g，pH6.5
2.2.3 仪器及试剂
2.2.3.1 主要仪器设备
药学论文参考
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3 生物催化过程中副产物 4-AD形成原因的初步研究......................18
3.1 引言.............................18
3.2 实验材料..............................18
3.2.1 菌株...................................18
4 降低生物催化副产物 4-AD方法的研究..........................27
4.1 引言..........................................27
4.2 实验材料..........................................27
5 1α-羟基去氢表雄酮生物催化条件优化研究...............................41
5.1 引言..............................41
5.2 实验材料..................................41
5 1α-羟基去氢表雄酮生物催化条件优化研究
5.2 实验材料
5.2.1 菌种
选择突变株中1α-OH DHEA产量较高的Z43进行生物催化条件的优化。
5.2.2 培养基
斜面培养基（1L）：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g，自然pH。 种子及发酵培养基（1L）：葡萄糖10.0 g、玉米浆粉10.0 g、硫酸铵2.0 g、磷酸二氢钾2.0 g，pH6.5
5.2.3 仪器及试剂
5.2.3.1 主要仪器设备
药学论文参考
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结论
本研究主要利用草酸青霉A-1006（Penicillium oxalicum A-1006）发酵培养，对底物DHEA的催化过程进行了研究，完成了副产物的分离纯化及结构鉴定，对副产物峰来源进行了初步研究，尝试了副产物4-AD的几种控制方法，包括酶抑制剂筛选、硫酸二乙酯诱变、常压室温等离子体诱变和紫外诱变，并对紫外诱变获得的突变株Z43生物催化过程中发酵培养基成分、发酵条件进行了优化。
本文通过实验研究获得了以下结论：
（1）在催化底物DHEA产生1α-羟基去氢表雄酮的过程中，转化液存在一较大副产物峰，保留时间为10.68 min，在24 h时浓度最高。对转化后发酵液经萃取、硅胶柱层析、结晶、重结晶得到类白色的副产物晶体，经单晶衍射、核磁共振、红外光谱、质谱、熔点确定副产物为雄烯二酮（4-AD）。
（2）4-AD的产生与菌株、添加的底物 DHEA有关联；4-AD不是培养基中的固有成分，其产生与清液是否加底物DHEA诱导无关，是由于菌株在培养基中生长过程中产生并分泌到细胞体外的一分子量大小在60 KD左右的酶蛋白催化作用。
（3）10种酶抑制剂均未对利用酶蛋白将DHEA转化为副产物4-AD的体外转化过程和摇瓶生物催化过程产生明显影响，未筛选到可使副产物峰4-AD显著降低或者消失的酶抑制剂。DES诱变筛选时，0.6%为最佳诱变浓度，此时菌株致死率为78.1%。DES诱变筛选共获得198株突变菌株，未获得副产物峰4-AD显著降低或者消失的菌株。ARTP诱变筛选时，100 s为最佳诱变时间，此时菌株致死率为77.6%。ARTP诱变筛选共分离出235株突变菌株，未获得副产物峰4-AD显著降低或者消失的菌株。
（4）紫外诱变筛选时，80 s为最佳诱变时间，此时菌株致死率为76%。紫外诱变筛选实验共分离出212株突变菌株，其中2株突变菌株Z43和Z106的转化液中4-AD浓度分别为0.09 g/L和0.12 g/L，远低于出发菌株的4-AD浓度；同时测定其转化液中1α-OH DHEA的浓度，两株突变株比对照组均显著提高，突变株Z43转化液中1α-OH DHEA浓度为3.51 g/L，突变株Z106为3.43 g/L，此时两突变株转化率分别为70.2%和68.6%，较原菌株分别提高了74.6%和70.6%。SDS-PAGE验证与摇瓶筛选结果相符，这两株突变株在60 KD左右的位置上只显示出很浅很细的条带。斜面传代实验证明这突变株Z43和Z106具有良好的遗传稳定性。
参考文献（略）