本文是一篇医学论文，本研究拟首先通过siRNA文库，qPCR，IFA等技术，筛选对NDV复制具有调控功能的ESCRT复合物亚基；随后，通过CRISPR/Cas 9技术构建相关ESCRT复合物亚基敲除细胞系，并以此敲除细胞系为模型进一步探究相关ESCRT复合物亚基在NDV复制周期调控中的具体作用。
第一章调控NDV复制的关键ESCRT复合物亚基的鉴定
1材料
1.1病毒、细胞
基因Ⅳ型毒株Herts/33(基因登录号：AY741404)由Dr.D.J.Alexander(AnimalHealth and Veterinary Laboratories Agency,UK)馈赠，并由本实验室保存；SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，并由本室孵化至9-10日龄；鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts,CEF）为本实验室制备；实验用HeL a细胞购自美国菌种保藏中心（ATCC,CRL-12203）。pCAGGS由本实验室保存。
1.2主要试剂
DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素以及高保真DNA聚合酶Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity均购自美国Invitrogen Life Technologies公司；PBS、1%鸡红细胞参考OIE标准方法由本实验室自制；TransIntro EL Transfection Reagent、TransDetect Double-LuciferaseReporter Assay Kit、Fast Mutagenesis System Kit、TransScript All-in-One First-StrandcD NA Synthesis SuperMix、TransScript Green One-Step qRT-PCR Super Mix、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell以及DNA Marker均购自北京全式金生物技术有限公司；5×RT Buffer、dNTPs、RNasin、Reverse transcriptase以及所有限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；即用型无缝克隆试剂盒Ready-to-Use Seamless Cloning Kit购自生工公司；EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京原平皓生物有限公司；质粒小提试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自美国AXYGEN公司；RIPA裂解液、100nM PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒，PVDF膜、SDS-PAGE电泳液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Western转膜缓冲液、SDS-PAGE预制胶、超敏ECL化学发光试剂盒、预染蛋白marker、羊抗鼠β-actin抗体、羊抗鼠Flag抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗均购自上海碧云天生物科技有限公司；增强型CCK-8（#C0042）购自碧云天生物公司（中国）；
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2方法
2.1 ESCRT各亚基siRNA的设计及合成
根据已有文献报道设计并合成24条针对ESCRT各亚基siRNA，本研究涉及到的siRNA均由苏州吉玛基因合成，具体序列如表1-2所示。
医学论文参考
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第二章HRS敲除细胞系的构建及鉴定
1材料
1.1毒株和细胞
人宫颈癌上皮细胞系HeL a购自美国菌种保藏中心（ATCC），鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）细胞由9日龄SPF鸡胚制备而成。毒株Herts/33由本实验室自己构建和拯救。
1.2主要试剂
抗NDV HN蛋白的小鼠单克隆抗体、抗HRS鼠单克隆抗体购自Santa CruzBiotechnology。嘌呤霉素（Puromycin）购自Merck Millipore。抗β-actin单克隆抗体（A1978）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔Ig G二抗购自Sigma-Aldrich。组织细胞RNA提取试剂盒（离心柱型）（Safe）购自武汉君诺德生物技术有限公司；E.coli DH5αCompetent Cells购自宝日生物技术（北京）有限公司；HiScript III RT SuperMix forqPCR(+gDNA wiper)、AceQ qPCR Probe Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。同源重组酶pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Ki（tCU101-03）购自全式金。RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒，PVDF膜、SDS-PAGE电泳液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、Western转膜缓冲液，SDS-PAGE预制胶、超敏ECL化学发光试剂盒、预染蛋白marker均购自上海碧云天生物科技有限公司。
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2方法
2.1 sgRNA的设计及合成
使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）和benchling（https://www.benchling.com/crispr）设计针对HRS及其全部剪切体的三条sgRNA，序列如表2-1所示
医学论文怎么写
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第三章HRS对NDV复制周期影响的探究.................................66
1材料.............................................67
1.1细胞及毒株...................................67
1.2主要试剂..................................67
全文结论.......................................65
4讨论
研究NDV感染阶段对于我们深入理解该病毒的传播和病理机制至关重要。NDV对全球禽类养殖业造成了严重的经济损失和健康威胁。在感染过程中，NDV复制经历了一系列阶段，其中包括入侵、转录、复制、出芽等[171]。首先，NDV通过与宿主细胞表面受体的相互作用，进入宿主细胞。随后，病毒的RNA基因组被释放并转录成负义链RNA，然后再转录为正义链RNA。这些RNA作为模板用于合成新的病毒基因组RNA和结构蛋白质，从而产生新的病毒颗粒。这些颗粒最终通过细胞质膜的包装和释放进入细胞外，继续感染其他细胞或宿主[172]。研究NDV复制阶段有助于揭示病毒与宿主细胞之间的相互作用、病毒基因组的复制机制以及潜在的抗病毒治疗靶点。此外，深入了解NDV复制阶段有助于开发针对该病毒的新型疫苗或治疗方法。因此，研究NDV复制阶段对于应对该病毒的传播和感染具有重要意义，有助于制定更有效的NDV防控策略。
在本章节研究中我们探究了HRS在NDV复制过程中各个阶段的作用。首先在NDV的吸附阶段，敲除HRS并不影响NDV病毒粒子的结合数量，与对照组相比没有显著差异，这表明HRS在NDV的吸附阶段不是必需的。进一步的RNA和蛋白质水平的分析也支持了这一结论，敲除HRS并未减少细胞结合NDV的RNA丰度和蛋白表达水平。其次，在NDV的内化阶段，敲除HRS并不影响NDV的内化过程。通过在4℃条件下预先阻止NDV的内化，然后在37°C下进行内化，HRS的敲除并没有显著影响NDV的内化，与对照组相比没有显著差异。这一结果同样也与RNA、蛋白质水平的分析结果一致。
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全文结论
1.本研究设计并合成针对ESCRT各亚基的24条siRNA及qPCR引物；24条siRNA对细胞均无显著的毒性影响且敲低效率较高。
2.通过Western blot、IFA、qPCR等试验研究发现，敲低HRS、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C能够抑制NDV复制，且敲低HRS抑制病毒复制效果更显著；过表达HRS能够促进NDV复制，HRS对于NDV的复制具有正向调控作用；NDV感染能够诱导HRS的基因和蛋白的表达水平上调，并具有一定的时间依赖性。
3.成功构建三个lentiCRISPR V2-HRS重组质粒，确定嘌呤霉素药筛浓度为1.5μg/mL；成功筛选获得32株单克隆细胞株；成功构建HRS敲除细胞系并将其命名为HeL a-HRS-KO细胞；利用HeL a-HRS-KO细胞，通过Western blot、qPCR、TCID50、IFA、生长曲线测定验证得出敲除HRS能够显著抑制NDV复制。
4.成功验证敲除HRS对于NDV的吸附、入侵、复制阶段无显著性影响，但能够显著抑制NDV的出芽阶段。
参考文献（略）