本文是一篇药学论文，本研究分析得出：IFITM2能够显著抑制EMCV的增殖，同时IFITM2能够通过靶向MDA5来促进IFN-β的表达，此外，IFITMs和I型IFN信号通路之间建立了正反馈循环，这对于其抗病毒作用的发挥起到至关重要的作用。
第一章绪论
1干扰素诱导跨膜蛋白概述
天然免疫在阻断病毒感染和减轻组织损伤中起到至关重要的作用[1]。已有研究报道，多种宿主蛋白参与抗病毒天然免疫应答[2]。在众多宿主蛋白中，干扰素诱导跨膜蛋白（interferon-induced transmembranes，IFITMs）是一类主要抑制病毒侵入宿主细胞过程的膜蛋白[3]，其在病毒生命周期的早期发挥作用，可抑制病毒的进入过程，因其具有抗病毒感染的独特能力，所以IFITM蛋白在先天免疫应答的过程中非常重要。IFITM蛋白不仅可以抑制病毒复制，还可以预防病毒相关疾病的后遗症出现，因此干扰素诱导跨膜蛋白具有成为抗病毒靶点药物的应用前景[4]。
1.1拓扑结构
IFITMs是CD225家族中重要蛋白，细胞内分布广泛[5][6]，IFITMs最初被发现是一种肿瘤相关因子[7]，后来被证实是干扰素刺激基因（interferon stimulatesgene，ISGs）表达的一类蛋白[8][9]。在人类中，IFITM蛋白家族由5个基因编码，包括免疫相关的IFITM1、IFITM2和IFITM3，以及在免疫中没有特有作用的IFITM5和IFITM10[10-11]，其表达主要受干扰素调控。IFITMs在肿瘤发生、免疫信号转导、生殖细胞归化等活动中发挥重要作用[7][12]。
IFITM1、IFITM2和IFITM3在细胞生物膜结构上具有相似的拓扑结构。截止到目前有三种模型得到认可，如图1-1A所示，N端结构域（N-terminaldomain，NTD）和C端结构域（C-terminal domain，CTD)均伸向腔内；胞内跨膜结域（Intramembrane domain，ID）和跨膜结构域（Transmembrane domain，TD）贯穿磷脂双分子层；短保守内保守环（Conserved intracellular loop，CIL）伸向胞质，其中靠近氨基端的跨膜结构域更为保守。近期有研究报道IFITMs的氨基端存在糖基化位点却没有被糖基化修饰，且C端还存在泛素化位点，通常跨膜蛋白N-端的糖基化和泛素修饰阳离子的C-端分别存在于跨膜蛋白的囊腔和胞质结构域，故有部分学者提出了第二种拓扑结构如图1-1B，跨膜结构域完全进入膜内，NTD、CTD和CIL均处在细胞质中，整个分子均在囊腔外侧[13][14]；结合第一、二种模型，有研究者提出该蛋白的最新结构模型如图1-1C，NTD和CIL定位于细胞质，CTD位于内体囊泡[15][16]。就目前预测的结果显示IFITMs均不具有酶结合区域，但两个跨膜区的胞质基部均存在物种特异性的信号序列，这说明IFITMs发挥抗病毒作用可能需要细胞内其他因子的协助[11][17]。
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2脑心肌炎病毒概述
脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是一种无包膜的小RNA病毒，具有直径30 nm的二十面体衣壳[42]，基因组由约7.8kb的正单链RNA组成，可将RNA直接翻译为多蛋白。其感染宿主要包括小鼠、猪、大象、狐猴、长臂猿等[44]。感染该病毒后，大多会影响动物的大脑和心脏，并在部分区域出现病灶，此外，EMCV感染可诱发糖尿病、神经系统紊乱，甚至对生殖机能也有一定影响[44][45]。EMCV能感染全部细胞，且表现出一定的组织嗜性。病毒感染过程中会导致细胞大规模裂解，使机体产生剧烈的炎症反应[43][46]。EMCV的致病力既受宿主因素的影响，同时与毒株也息息相关[47]。当前，随着该病毒的接连爆发和传播已经对国内和国际上畜牧养殖相关行业的发展酿成了巨大的经济损失，对世界公共卫生和人类健康产生了一定的威胁[48][49]。
2.1发现及分类
EMCV属于心病毒属，是不具有包膜的单股正链RNA病毒[43][48]。EMCV于1945年由美国迈阿密的Helwig和Schmidt首先从一只因肺水肿和心肌炎猝死的圈养雄性长臂猿身上分离出来。经静脉、腹膜、皮下、脑内或鼻腔注入过滤的长臂猿水肿液的小鼠，在一周内出现后肢瘫痪和心肌炎，随后死亡。病原体当时被命名为脑心肌炎病毒[50][51]。1948年，Dick等人在乌干达恩德培的Mengo区分离到一种Mengo病毒。它是从一只患有后肢瘫痪的圈养恒河猴身上分离出来的。1949年，交叉血清中和研究表明，Mengo和EMCV在抗原性上相互模糊，这意味着它们是同一物种的一部分。然而，它们与泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)不同，TMEV是另一种心脏病毒(比较分类)，根据病毒株的不同，该病毒可导致急性致死性脊髓灰质炎或慢性脱髓鞘疾病，并在小鼠的中枢神经系统持续存在[55]。此后，1980年Yoon等通过空斑实验对EMCV的M变异体进行了纯化又将其划分为两个亚型，包括糖尿病变异体型（D型）和非致糖尿病变异体型（B型）[56]。2005年我国首次在生病的动物体内分离并鉴定出EMCV[54]，随后我国其他地区也陆续发现了高同源性的毒株[57][58][59]。EMCV只有一种血清型，即孟戈病毒，是EMCV的一种毒株。
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第二章IFITMs蛋白对EMCV体外增殖的作用研究
1材料及仪器设备
1.1细胞、毒株、菌株
研究中所需的HEK293细胞、BHK-21细胞和EMCV PC21毒株均由西北民族大学生物医学研究中心保存并提供。细胞的培养条件为37℃，5%CO2培养箱恒温培养。所需培养基为10%NBS的DMEM培养基。细胞复苏、培养以及传代的过程均需严格遵守无菌原则，在超净工作台中进行操作。大肠杆菌感受态细胞BL21由西北民族大学生物医学研究中心保存并提供。
1.2试剂
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2.方法
2.1 pCMV-Myc-IFITMs真核表达载体的构建
2.1.1HEK293细胞总RNA的获取
参照全式金Transzol Up提取试剂的相关操作说明，进行细胞总RNA的提取，所得RNA溶液经浓度测定后放置于-80℃保存备用。
2.1.2引物设计
根据Geen Bank网站公布的IFITM1/2/3全基因组序列，利用Primer 5.0软件设计引物，交由西安擎科生物科技有限公司合成，引物序列如表2-1。
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第三章 IFITM2 蛋白激活 IFN-β信号通路的机制探索 .................... 32
1 材料及仪器设备 ................................ 32
1.1 细胞、毒株、菌株 .................... 32
1.2 主要试剂 .................................... 32
第四章 IFITM1/3 蛋白对 IFN-β信号通路的作用初探 ..................... 47
2材料及仪器设备 ............................ 47
1.1 细胞、毒株、菌株 ........................... 47
1.2 试剂 ......................... 47
第五章 结论............................ 57
第四章IFITM1/3蛋白对IFN-β信号通路的作用初探
3结果
3.1过表达IFITM1/3细胞培养上清抑制EMCV增殖
将HEK293细胞中转染IFITM1/3表达质粒，24 h后，收取细胞培养上清。再接种EMCV（MOI=0.001），换液时将上述收取的细胞培养液作为维持液，培养24 h后，收集细胞进行RT-qPCR检测。结果显示过表达IFITM1/3细胞上清处理组EMCV病毒拷贝数显著减少（图4-1），说明IFITM1/3过表达的细胞上清存在某些抗病毒因子，可以抑制EMCV在HEK293细胞内的增殖。
医学论文参考
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第五章结论
1.IFITMs蛋白通过抑制EMCV进入的过程进而有效的抑制EMCV的增殖；过表达IFITMs蛋白的细胞培养上清能够促进IFN-β的表达，其中IFITM2的作用效果是最显著的。
2.IFITM2通过靶向MDA5来促进IFN-β的表达，表明IFITM2蛋白对IFN-β免疫应答的调节构成了正反馈循环，这种反馈调节环可能在炎症感染和免疫反应期间体内的动态平衡和自我防御机制中发挥重要作用；IFITM2 N末端结构域的抗病毒能力强于C端，可能与N末端结构域促进IFN-β的能力强于C末端有关，表明IFITM蛋白通过增强IFN-β信号通路来增强其抗病毒效果。
3.IFITM1/3均能促进MDA5蛋白的表达，其中IFITM1与MDA5之间存在互作，IFITM3与MDA5之间不存在互作。
参考文献（略）