本文是一篇医学论文，本研究结果表明，NH2-HMSNs作为佐剂比弗氏佐剂激起更强的体液免疫反应。综上所述，NH2-HMSNs具有成为动物亚单位疫苗佐剂的潜力，研究结果为新型BVDV亚单位疫苗的研发提供技术支持，并借此构建以MSNs为抗原载体的亚单位疫苗平台。
第一章 前言
1.1牛病毒性腹泻病毒概述
牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）主要感染牛，孕期母畜感染BVDV可引起新生动物持续性感染（Persistently infected, PI），产生免疫耐受[1]。PI动物血清抗体呈阴性但终身向外排毒，是BVDV最重要的传染源。 根据BVDV基因遗传多样性以及抗原差异分析结果可将其分三大类，即BVDV-1（瘟病毒A, Pestivirus A），BVDV-2（瘟病毒B, Pestivirus B）和BVDV-3（瘟病毒H, Pestivirus H, HoBi-like virus）[2, 3]。目前，BVDV-1基因型含有至少22个亚型（a-v）[4]，BVDV-2和BVDV-3基因型分4个亚型（a-d）[5]。此外，BVDV宿主的范围也在不断扩大，涉及到猪、羊、骆驼和鹿等动物[6]。自1946年首次发现BVDV，对BVDV的研究已经持续70多年，尽管相关领域科研人员在BVDV分子生物学，发病机制，免疫应答与防控措施方面的研究取得很大进展，但目前BVDV仍严重威胁养殖业以及相关生物制品行业的发展。
1.1.1 BVDV基因组结构与特征
BVDV基因组由一条约12.5kb的单股正链RNA组成，有一个开放阅读框（open reading frame, ORF），两侧是非翻译区域5'-UTR和3'-UTR。5'-UTR包含一个内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site, IRES），负责翻译的启动[7]。3'-UTR含有保守的茎环，具有与病毒复制相关的宿主细胞microRNA（miRNA）的结合位点[8]。BVDV的ORF编码约4000个氨基酸，其在加工过程中被病毒和宿主细胞的蛋白酶切割为多肽，组装成病毒的4种结构蛋白和8种非结构蛋白，顺序依次为N端自体蛋白酶（Npro）、衣壳蛋白（C）、3种囊膜蛋白（Erns, E1和E2）、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[9]，图1-1。
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1.2 BVDV疫苗
20世纪90年代初，斯堪的纳维亚首先实施BVDV根除方案，瑞士在2008年启动的BVDV根除计划与之相似，即在不接种疫苗的前提下全面检测和捕杀受感染牛[41, 42]；到2020年底，瑞士99.5%以上的养牛场已经检测不到BVDV，但PI动物难以消除。在牛密度大、BVDV流行率高的地区，病毒传播风险大，实施全面检测和捕杀方案的经济成本和时间代价往往更高，因此控制与根除BVDV最优的策略是接种疫苗。
目前世界各地有超过120种注册BVDV疫苗产品在使用[43]。根据我国国家兽药基础数据库数据，截至2021年12月，有3种灭活疫苗获准注册，包括由BVDV NM01株（1型）制成的单价疫苗，BVDV NMG株与IBRV LY株制成的二联疫苗和BVDV NM01株和IBRV LN01/08制成的二联疫苗。尚无进口疫苗获准在国内注册。
1.2.1常规疫苗在BVDV中的应用
常用BVDV疫苗有传统修饰活病毒（conventional modified live virus, MLV）疫苗与灭活疫苗两种。MLV疫苗往往能诱导高滴度的病毒中和抗体，并提供更长的保护时间，因此与需要加强免疫才能获得持续保护的灭活疫苗相比，MLV疫苗更有效。然而，MLV疫苗有可能恢复强毒性或与野毒株发生重组并引起感染。有报道称接种MLV的动物可能出现短暂病毒血症并释放疫苗病毒[44]。另外，妊娠动物接种活病毒疫苗存在疫苗病毒垂直传播的风险，有时会引起胎儿并发症或导致PI犊牛出生[45]。接种MLV疫苗也可能引起黏膜疾病，当胎儿在子宫内感染病毒而对BVDV不产生免疫反应时，会导致流产，流产胎儿口腔和肠道黏膜有明显严重的病变[46]。考虑到疫苗的安全性问题，种牛通常首选接种灭活疫苗，但新生牛全血细胞减少症（bovine neonatal pancytopenia, BNP）的出现表明，灭活疫苗也存在安全隐患。BNP是一种与BVDV灭活疫苗相关的综合征，在犊牛出生后第一个月，常呈全血细胞减少、严重出血并伴随高死亡率。有文献报道，为避免过敏或其他不良反应出现，应选取牛同种细胞系中来制备病毒疫苗，但仍存在安全风险[47, 48]。
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第二章 BVDV毒株的分离与鉴定
2.1试验材料
2.1.1样品和细胞
本研究所用样品为BVDV阳性牛血清，细胞为MDBK细胞，均来源于西北民族大学生物医学研究中心实验室保存。
2.1.2主要试剂
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2.2试验方法
2.2.2细胞准备
从液氮罐复苏MDBK细胞，在37℃的水中将其快速融化。转移至无菌1.5mL离心管中，800rpm，室温离心6min，吸弃冻存液。用1mL含10%FBS的DMEM细胞培养基重悬细胞后移至T25细胞瓶中，补加4mL细胞培养基，轻轻混匀，放置37℃，5%CO2细胞培养箱中过夜培养。细胞生长至密度约90%以上时，弃去培养基，使用无菌PBS润洗3次细胞，加1mL胰酶消化细胞，然后加1mL含10%FBS的DMEM细胞培养基终止消化，并用移液器将瓶壁上的细胞吹落，轻轻吹打混匀制成悬液。将细胞悬液移至干净的离心管中，室温下800rpm，离心6min，吸弃上清，用细胞培养基重悬细胞后进行传代培养。
2.2.3病毒分离
待T25细胞瓶中MDBK细胞密度约80%且状态良好时，弃去培养基，使用无菌PBS润洗细胞并向T25细胞瓶中加3mL无菌PBS备用。将超低温冰箱中保存的BVDV阳性牛血清放在冰上待其缓慢融化，在生物安全柜中吸取2mL至15mL离心管中，并加入2mL无血清DMEM培养基，混匀后使用0.22μm滤器过滤，冰上保存备用。
弃去细胞瓶中的PBS，吸取2mL稀释的BVDV阳性牛血清样品加至细胞瓶中，同时设置阴性对照，在37℃，5%CO2细胞培养箱中感染作用2h。补加3mL含2%FBS的DMEM细胞维持液，37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，期间每隔24h观察细胞的状态。待5d后终止感染，超低温冰箱反复冻融3次，将细胞和培养基吹打混匀收集在无菌离心管中，以10000rpm，4℃条件离心10mim后收集上清液。吸取1mL上清液按上述步骤继续感染MDBK细胞，进行病毒盲传培养，用显微镜观察细胞出现细胞病变效应，将感染的细胞与培养物反复冻融3次后保存在超低温冰箱中。
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第三章 BVDV yE2 蛋白原核表达及纯化 ....................... 20
3.1 试验材料 ........................................... 20
3.1.1 质粒与细胞 ...................................... 20
3.1.2 主要试剂 ....................................... 20
第四章 介孔硅作蛋白载体的研究 ........................... 31
4.1 试验材料 .................................... 31
4.1.1 主要材料 ............................... 31
4.1.2 主要试剂 ............................... 31
第五章 免疫效果初步评价 ........................... 39
5.1 试验材料 ..................................... 39
5.1.1 主要材料 .................................... 39
5.1.2 主要试剂 ........................ 39
第五章 免疫效果初步评价
5.3试验结果
5.3.1小鼠体重检测
免疫期间密切观察小鼠的健康状况，免疫后小鼠状态良好，注射部位未见发炎、破溃。测量每次免疫前小鼠的体重，图5-2，各组小鼠体重变化趋势基本一致，结果表明NH2-HMSNs介孔二氧化硅纳米材料和弗式佐剂不会对小鼠正常生长造成负面影响。
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第六章 结论
1. 从BVDV阳性牛血清中分离出一株BVDV，其生物型为细胞病变型，基因型为1型，符合BVDV目前在我国的流行率。检测其TCID50为105.5。
2. 依据BVDV分离株构建BVDV E2基因截断pET-28a-yE2原核表达载体，通过IPTG诱导、使用镍柱亲和层析技术纯化出具有免疫原性的重组蛋白yE2。
3. 筛选对yE2蛋白负载能力强、具有缓释效果且体外检验安全的NH2-HMSNs介孔二氧化硅纳米材料作为BVDV yE2蛋白亚单位疫苗的载体与佐剂。
4. NH2-HMSNs介孔二氧化硅纳米材料作为佐剂可以刺激小鼠机体产生一定的体液免疫反应和细胞免疫反应，NH2-HMSNs作为佐剂在体液免疫水平上比弗氏佐剂表现出优势。
参考文献（略）