本文是一篇药学论文，本文阐述了五味子藤茎提取物即单体木脂素成分对Cisplatin诱导的小鼠生精障碍的改善作用及其作用机制。
第一章 五味子非药用部位研究进展
1.1 五味子非药用部位化学成分研究进展
五味子应用历史悠久，其主要入药部位为果实。但随着近些年药用资源紧缺，对五味子非药用部分（藤茎，果梗，叶片等）的研究逐渐增多，尤其以五味子藤茎为代表。相关研究表明五味子藤茎中含有丰富的化学成分，迄今为止，从该植物中共分离鉴定了306个和238个化合物[5]。主要以木脂素类，多糖，挥发油，有机酸类为主[6]。
1.1.1 木脂素类
木脂素作为五味子最主要的化学成分，同时也是药理活性最高的有效成分[7]。因此，目前有关五味子非药用部位中木脂素类成分的研究屡见不鲜，主要集中于对木脂素类成分的含量测定以及分离鉴定。木脂素是一类由两个或多个苯丙素（C6-C3结构）单元衍生的天然化合物[8]。现代研究表明，五味子非药用部位主要含有的木脂素类成分可分为五种类型，螺苯骈呋喃联苯环辛稀木脂素， 4-芳基四氢萘木脂素，2,3-二甲基-1,4-二芳基丁烷木脂素，2,5-二芳基四氢呋喃木脂素以及联苯环辛二稀型木脂素。而五味子中木脂素以联苯环辛二烯型木脂素为主[9]。而目前有关五味子非药用部位的研究中主要以五味子酯甲（Schisandrol A），五味子酯乙（Schisandrol B），五味子醇甲（Schisantherin A），五味子醇乙（Schisantherin B），五味子甲素（Schizandrin A），五味子乙素（Schizandrin B），五味子丙素（Schizandrin C）七种木脂素为主。其结构如图1-1所示[10]。董培良[11]等采用正交实验，以乙醇体积分数、提取时间、溶剂倍数、提取次数为影响因素，对五味子藤茎中木脂素成分的提取进行工艺优化，同时采用单因素法探究了木脂素纯化的最优条件，最终确定了最佳提取工艺为8倍量95%乙醇提取2次，每次提取1 h。最佳纯化工艺为AB-8型大孔吸附树脂，木脂素上样浓度为2.0 mg/mL，最大上样量70 mL，洗脱剂体积分数95%，洗脱剂用量为80 mL。
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1.2 五味子非药用部位药理活性研究进展
目前，大量研究表明，五味子非药用部位具有与果实中相似的化学成分。相关报道称五味子藤茎中含有与果实相似的木脂素类成分。与此同时，因五味子非药用部位中的化学成分具有同样具有较强的药理活性，目前有关其对疾病的防治及改善作用的研究日益增多。尤其以木脂素类成分代表。因此，下面将对五味子非药用部位中主要化学成分的药理作用进行总结。
1.2.1神经系统保护作用
多项研究显示五味子非要用部位所含的木脂素类物质，对阿尔兹海默病有较好的治疗效果[36]。在体外试验中，我们发现五味子乙素可以显著地降低由H2O2引起的PC12细胞的凋亡，其机理是通过抗氧化和下调p53的表达来实现的。故此，认为五味子乙素具有一定的脑保护作用[37]。五味子丙素可以通过抑制相关神经细胞中ATP引起的Ca2+升高，同时通过降低神经胶质瘤细胞系C6和PC12细胞的细胞膜电位，来抑制细胞生长。最终起到一定的脑保护作用[38]。Lee等比较了7 种五味子木脂素对活化T 细胞核因子( Nuclear factor of activated T cells，NFAT) 的抑制活性，发现戈米辛N和五味子醇甲的活性强于戈米辛E、五味子甲素、五味子丙素、苯甲酰异戈米辛O和五味子醇乙[39]。五味子醇甲和五味子乙素对H2O2所致的PC12 细胞氧化损伤同样具有保护作用，其保护作用机制与清除自由基、减少自由基的生成、降低其对DNA 的损伤或通过激活细胞内抗氧化酶[40]。还有报道表明，五味子乙素和丙素可通过抗氧化与抗凋亡通路对有关β淀粉样蛋白（Aβ）和同型半胱氨酸所致的PC12 细胞起到保护作用[41]。
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第二章 中药有效成分对生精障碍改善作用的研究进展
2.1生精障碍的研究进展
精子的产生是一个及其复杂的生理过程，因此在精子生成过程中极易受到影响，而目前导致生精障碍的主要原因为体内外环境变化对睾丸产生刺激，进而导致精子不能正常产生，精子畸形，精子活性下降等[64]。
2.1.1引起生精障碍的原因及模型的建立方法 目前引起生精障碍的原因大体可以分为三类，外部环境刺激，体内药物干预以及慢性疾病导致的并发症。因此，当前有关生精障碍动物模型的建立也以上述三类为主。
2.1.1.1外部环境刺激诱导的生精障碍
李双等[65]采用低压氧舱模拟海拔5000 m处理4周建立缺氧小鼠模型，可以导致小鼠雄性生殖细胞凋亡，精子质量下降。禹刚[66]等则探究了移动电话FR-EMR对精子发生的影响，结果发现，FR-EMR导致生殖毒性的机制效应可能与精子氧化应激损伤、内分泌紊乱及蛋白激酶复合体活性下降等有关。而刘伟[67]等则通过阴囊热应激法造成小鼠睾丸损伤而建立生精障碍模型。陈天惟[68]等则将小鼠暴露于频率为2450 MHz连续微波，功率密度为40 mW/cm2,辐射18 d, 每天1 h，以此造成小鼠生精障碍模型。叶一凡[69]等则通过6 Gy60Coγ射线一次性全身照射对C57BL/6J小鼠血睾屏障的损伤。
2.1.1.2药物干预诱导的生精障碍
体内药物干预也常作为建立生精障碍模型的方式。常用的药物有环磷酰胺（cyclophosphamide CTX ），醋酸铅（Lead acetate LA），雷公藤多苷（Tripterygium wilfordii polyglycoside TWP），顺铂（Cisplatin）等。Rezazadeh Y[70]等对雄性小鼠注射12 mg/kg的环磷酰胺，连续7天造成了小鼠睾丸损伤。有研究表明，连续7天对雄性小鼠灌胃40 mg/kg的雷公藤多苷可以成功导致其精子发生障碍[71]。
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2.2中药有效成分改善生精障碍的研究进展
中药具有多途径，多靶点协同多久机制的治疗特色，近些年来由于男性不育患病率逐年升高。而精子发生障碍，精液质量下降，是导致男性不育的主要原因之一。由于目前临床治疗生精障碍的药物均具有一定的依赖性和副作用，因此，有关中药治疗男性精子发生障碍的研究逐年增多。
2.2.1五味子中有效成分治疗生精障碍研究进展
五味子作为传统的大宗药材，本身具有固精，收涩的功效。更因其作为传统治疗男性不育中药复方五子衍宗丸的组成部分。因此，目前有关其治疗生精障碍的报道逐渐增多。
有研究表明，五子衍宗丸可通过影响小鼠睾丸组织细胞连接的动态重塑来挽救TAp73抑制相关的少弱精子[95]。林瑞超[59]等，研究发现五味子乙素可以修复不育小鼠的睾丸组织损伤，显著增强精子的数量、活力、速度、空间运动能力和受精能力。同时有研究显五味子水提物可以通过氧化应激、ER应激和线粒体介导的睾丸生殖细胞凋亡信号通路之间的交叉作用改善精索静脉曲张诱导大鼠的睾丸功能障碍[96]。李瑞博[97]则发现五味子甲素可以通过调控抗凋亡基因SCF表达以抑制SCF/c-kit信号通路产生的异常凋亡来改善SD大鼠少、弱精子症。张燕[98]等则发现五味子多糖可以改善环磷酰胺所致大鼠生精障碍，其结果显示，五味子多糖在100、200、400 mg/kg可以呈剂量依赖的改善环磷酰胺引起的精子畸形以及睾丸性激素水平紊乱。其机制可能与恢复下丘脑-垂体-性腺轴的调控功能有关。
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第三章 五味子藤茎提取物对 CISPLATIN 致小鼠生精障碍改善作用及作用机制 ........................... 40
3.1 材料与仪器 ............................. 40
3.2 实验结果 ................................ 44
第四章 五味子醇乙(SCHISANDROL B )对 CISPLATIN 致 TM3 细胞损伤的改善作用 ......................... 54
4.1 材料与方法 .................................. 55
4.2 结果与分析 ......................................... 58
结论 ............................ 70
讨论
药学论文参考
为探究五味子中七种主要木脂素类成分对Cisplatin导致的TM3细胞损伤的改善作用。本研究首先从评估了五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素，的安全性以及药效。进一步从七种木脂素中筛选出药理活性较好的五味子醇乙 (Sol B) 进行后续深入的研究。本章节试验主要从抗氧化应激、抗凋亡及对激素合成的影响等方面多角度评估了Sol B的对TM3细胞的保护作用，并进一步探究相关作用机制。
小鼠睾丸间质细胞（Leydig cells TM3）作为睾丸组织中合成并分泌雄性激素的主要细胞，对精子生成有着至关重要的作用[144]。其功能受到影响会导致男性生精障碍的产生[86]。目前有研究显示，TM3细胞功能障碍的主要原因与其受到外界刺激后产生的氧化应激以及细胞凋亡有关[145]。主要机制与细胞凋亡作用与Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡关键蛋白以及氧化应激相关蛋白Nfr2和HO-1密切相关[146]。Cisplatin是目前应用最广泛的化疗药物，其有效性已得到深入研究，但cisplatin的使用会增加自由基和ROS的产生，从而克服靶细胞的抗氧化能力，导致氧化应激以及细胞凋亡[147]。因此，在Cisplatin模型中，SOD和CAT水平会明显减少，而Sol B可有效抑制以上2种酶的消耗。而GSH作为细胞中的抗氧化剂，可以抑制由于外界刺激导致的ROS过度堆积现象，而在模型组中ROS表达量显著增加，而GSH含量的降低。但是Sol B的使用对顺铂诱导的以上现象有明显的改善作用。同时我们对抗氧化应激的重要蛋白Nfr2和HO-1的表达量进行分析发现，Cisplatin可以导致Nfr2和HO-1表达量降低。而Sol B可以有效地逆转由顺铂引起的TM3细胞Nfr2和HO-1表达量下降。以上研究结果与此前报道基本相符。
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结论
1.通过HPLC、GC-MS等检测手段对五味子果实、藤茎及果梗中的木脂素、多糖和挥发油类成分进行综合分析。比较五味子果实及其非药用部位（藤茎、果梗）中有效成分含量的差异，发现五味子藤茎中的木脂素和挥发油类成分具有较大的开发利用价值。
2.通过HPLC法检测不同产地和年生五味子藤茎中木脂素类成分的含量，揭示了五味子藤茎中木脂素含量与产地和年生之间的关系。发现再3-5年区间内五味子藤茎中木脂素含量与年生呈一定成分的正相关。并且提供了一种五味子藤茎中木脂素高效提取的方法，即超高压提取法，并对其进行工艺优化。
3.通过Cisplatin建立的小鼠生精障碍模型。发现五味子藤茎提取物可以有效的改善Cisplatin引起的生精障碍。其主要其作用机制可能是通过改善由Cisplatin导致的氧化应激反应。可通过调节Nrf2\HO-1蛋白水平，PI3K\AKT，细胞凋亡，MAPK信号通路以及睾酮合成路径中的17βHSD，cycp450，Star。进一步说明，五味子藤茎具有很好的开发潜力。
4.体外建立Cisplatin引起的睾丸间质细胞（TM3）损伤，发现五味子藤茎中的五味子醇乙（Sol B）可以通过抑制TM3细胞中部的ROS产生，并通过提高Bcl-2的表达来改善Cisplatin造成的损伤。此外，Sol B还可以抑制Erk蛋白的过度磷酸化，进而逆转TM3细胞中的睾酮生成障碍。说明Sol B可以作为一种潜在的治疗生精障碍的药物。
参考文献（略）