本文是一篇药学论文，笔者通过研究灰兜巴不同溶剂提取部分对PPARγ的激活作用，选择激活作用最强的提取部分，研究激活PPARγ后对高糖诱导下的肾小管上皮细胞HK-2中层粗连蛋白(Laminin,LN)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、TGF-β、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、p-Smad2/3等相关蛋白表达的影响，探讨灰兜巴通过激活PPARγ抑制TGF-β/Smad信号通路，减轻高糖诱导的HK-2细胞纤维化机制。
材料与方法
1仪器与材料
1.1实验仪器
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1.3主要试剂的配制
①膜封闭液：称取1g脱脂奶粉，溶于20mL TBST溶液中，涡旋混匀后，置于摇床30min，室温放置，现配现用；
②APS（10%）：称取1g过硫酸铵粉溶于10mL超纯水中，涡旋混匀后，分装于1.5mL的EP管中，−20°C冰箱冻存备用；
③5×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取5g SDS、15.1g Tris和94g甘氨酸添加至1L锥形瓶中，用超纯水定容至1L；
④1×SDS-PAGE电泳缓冲液：取200mL 5×SDS-PAGE的电泳缓冲液添加至1L容量瓶中，超纯水定容至1L；
⑤1×TBST：称取8.8gNaCl、20mL 1M Tris-HCl(pH8.0)、800mL去离子水溶解，再添加0.5mL Tween-20；
⑥5×转膜缓冲液：称取Tris 15.1g、甘氨酸76g，置于1L容量瓶中，超纯水定容至1L，混匀，室温放置；
⑦1×转膜缓冲液：使用量筒取200mL 5×转膜缓冲液、200mL甲醇、超纯水定容至1L，混匀后使用；
⑧细胞完全培养基：5mL胎牛血清，500μL的青链霉素抗生素，加入MEM培养基至50mL；
⑨细胞冻存液：500μL DMSO，4.5mL 胎牛血清，5mL MEM。
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2实验方法
2.2 HK-2细胞高糖模型的构建
查阅文献可知，常用的处理肾小管上皮细胞的高糖条件是加入30mmol/L的葡萄糖[6-7]。将消化的细胞计数后，以2×105/mL的密度接种至六孔板中，培养24h，待细胞贴壁，融合率达70%~90%，取出细胞，给药，分组如下：
①对照组：在细胞中加入2mL的完全培养基，置于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中培养；
②24h组：在细胞中添加含葡萄糖浓度为30mmol/L的培养基2mL，置于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中培养24h；
③48h组：在细胞中添加含葡萄糖浓度为30mmol/L的培养基2mL，置于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中培养48h；
④72h组：在细胞中添加含葡萄糖浓度为30mmol/L的培养基2mL，置于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中培养72h。
经不同处理后，收集细胞上清液，测定上清液中FN、LN的含量，确定造模时间。
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2.3灰兜巴STC对高糖刺激下HK-2细胞的影响
将生长状况良好的细胞进行消化计数，以2×105/mL的密度接种到100mm的培养皿中，培养24h，待细胞贴壁，融合率达70%~90%，取出细胞，给药，分组如下：
①对照组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM继续培养48h，再更换培养液，培养24h；
②模型组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM，加入30mmol/L葡萄糖作用48h，更换MEM，再加入浓度为30mmol/L的葡萄糖培养24h；
③吡格列酮组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM，加入浓度为30mmol/L葡萄糖作用48h，更换培养液，加入终浓度为30mmol/L的葡萄糖和浓度为0.75μg/mL的吡格列酮培养24h；
④灰兜巴STC高浓度组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM，加入浓度为30mmol/L葡萄糖作用48h，更换培养液，加入浓度为30mmol/L的葡萄糖和浓度为400μg/mL的灰兜巴STC培养24h；
⑤灰兜巴STC中浓度组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM，加入浓度为30mmol/L葡萄糖作用48h，更换培养液，加入浓度为30mmol/L的葡萄糖和浓度为200μg/mL的灰兜巴STC培养24h；
⑥灰兜巴STC低浓度组：HK-2细胞培养24h后，更换MEM，加入浓度为30mmol/L葡萄糖作用48h，更换培养液，加入终浓度为30mmol/L的葡萄糖和终浓度为100μg/mL的灰兜巴STC培养24h。
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第三部分灰兜巴激活PPARγ抑制TGF-β/Smad信号通路改善高糖诱导HK-2细胞纤维化的机制研究…………………………41
前言………………………………41
1材料与方法…………………41
结果……………………………49
讨论…………………………55
小结………………………57
5讨论
肾脏纤维化是糖尿病肾病晚期的主要病理特征[8]，在肾脏纤维化发展过程中，30%~40%肾小管上皮细胞发挥着重要作用[9]，其病变是糖尿病肾脏纤维化病理改变之一[10]。各种细胞外的异常信号如TGF-β激活、CTGF和AGEs堆积、FN和LN的增多、活性氧增加、血流动力学改变等均可使肾小管上皮细胞功能与结构发生改变，分泌过量ECM，造成ECM沉积[11-13]。随着ECM堆积及多种细胞因子的释放，肾脏纤维化也会逐渐加重。因此抑制肾小管上皮细胞病理改变，减少纤维化细胞因子的产生和ECM的堆积[14]，可以有效延缓糖尿病肾脏纤维化的进程。其发病机制与多种因素有关，其中PPARγ的激活就可降低ECM的沉积和相关细胞因子的表达，因此本实验进一步探讨了灰兜巴STC是否通过激活PPARγ而抑制TGF-β/Smad通路下调肾脏纤维化各种蛋白的表达改善糖尿病肾脏纤维化。
高糖环境是糖尿病肾脏纤维化发生、发展的重要原因，本实验用30mmol/L的葡萄糖刺激肾小管上皮细胞，模拟糖尿病肾脏纤维化模型。进行了葡萄糖作用时间摸索，以寻找合适的造模时间。实验结果表明，随着葡萄糖作用时间的增加，上清液中FN、LN的表达逐渐升高，与对照组相比，处理时间为72h细胞上清液中的FN、LN含量显著升高，最终选取造模作用时间为72h。实验结果显示，高糖刺激下肾小管上皮细胞中的FN、LN、TGF-β、CTGF、p-Smad2/3等肾脏纤维化蛋白的表达较对照组显著升高，因此可得高糖可诱导肾小管上皮细胞形态、结构和功能发生改变。在上一部分的研究中我们得出，灰兜巴的一些溶剂提取部分可有效激活PPARγ，其中灰兜巴STC对PPARγ的激活效率最高，但灰兜巴STC是否通过激活PPARγ，达到延缓高糖诱导的HK-2细胞纤维化有待进一步研究。为了研究灰兜巴STC是否通过激活PPARγ抑制TGF-β/Smad通路从而延缓高糖引起的HK-2细胞纤维化，本实验首先通过WB、ELISA实验得出，灰兜巴STC可抑制TGF-β/Smad信号通路，降低FN、LN、TGF-β、CTGF、p-Smad2/3等肾脏纤维化相关蛋白的表达，且研究结果表明，高浓度灰兜巴STC对TGF-β/Smad信号通路抑制作用最强。
药学论文参考
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小结
建立高糖诱导肾小管上皮细胞损伤模型，验证了TGF-β、CTGF、p-Smad2/3、FN、LN等肾脏纤维化相关蛋白过量表达，通过给予灰兜巴STC后，HK-2细胞纤维化相关蛋白表达显著降低，而SiRNAPPARγ组给予相同的灰兜巴STC后相关蛋白表达并未显著降低，因此可知灰兜巴STC抑制TGF-β/Smad信号通路改善高糖诱导的HK-2细胞纤维化与激活PPARγ有关。
参考文献（略）