本文是一篇药学论文，本结合网络药理学预测鹿茸抗前列腺癌作用机制，通过ROS染色、Western blot及NAC拮抗实验进一步明确DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis对PC-3M细胞的抑制作用是基于ROS介导的PI3K/AKT信号通路发挥作用的。
第一章 鹿茸蛋白的理化性质研究
1.1 实验用品
1.1.1实验材料
鹿茸总蛋白（Deer antler protein，DAP）、蛋白组分-Ⅰ（DAP-Ⅰ）和蛋白组分-Ⅱ（DAP-Ⅱ）为实验室自制[70]，纯度分别为86.32%、88.09%，89.85%（分光光度法）。其中DAP-Ⅰ蛋白分子量主要集中在55-70 kDa，DAP-Ⅱ蛋白分子量主要集中在30-40 kDa[70]。
1.1.2实验试剂
盐酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；金龙鱼大豆油购自益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.1.3 实验设备
PL303电子分析天平、PHS-3E标准型pH计均购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ST16R小型高速冷冻离心机，购自美国Thermo Fisher公司； BSG-28电热恒温水浴锅，上海惠诚生物科技有限公司；DHG-9073A电热恒温鼓风干燥箱，购自上海申贤恒温设备厂；BioTek Epoch全波长酶标仪，美国BioTek仪器有限公司；HCT-3热重分析仪，购自北京恒久科学仪器厂；T10 basic S25手持高速匀浆机，购自德国IKA集团；JSM-IT200扫描电子显微镜，购自日本电子株式会社。
药学论文参考
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1.2 方法
1.2.1微观结构观察
将冻干后的DAP及DAP-Ⅰ和DAP-Ⅱ采用导电胶粘贴在样品台上，并在表面喷一层金粉，采用扫描电子显微镜观察微观结构并拍照记录。
1.2.2 热稳定性
分别称取10mg DAP、DAP-Ⅰ和DAP-Ⅱ放入坩埚中进行检测。采用流动氮气保护，测定温度范围30-800℃，升温速度10℃/min。检测完毕后对数据进行绘制热重曲线进而分析其热稳定性。
1.2.3 溶解度的测定
将10 mgD AP、DAP-Ⅰ和DAP-Ⅱ分别溶于蒸馏水中，配制成1%的样品溶液（w/v）的蛋白溶液，使用1M HCl和1M NaOH调节pH至3-10，涡旋混匀后，5000 rpm离心15 min后，取上清进行蛋白含量测定，并通过以下公式计算溶解度：
溶解度ሺ%ሻ=上清液中蛋白含量总蛋白含量×100% （1.1）
1.2.4 乳化性（EAI）及乳化稳定性（ESI）
称取DAP、DAP-Ⅰ和DAP-Ⅱ，加入蒸馏水制成1%的样品溶液（w/v），吸取3 mL样品溶液使用1M HCl和1M NaOH分别调节pH至3-10，加入大豆油（样品：大豆油=3:1），使用高速匀浆机10000 rpm搅拌1 min后，吸取50 μL加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸钠溶液测定500 nm处吸光度值，记录吸光度A1。
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第二章 基于网络药理学预测鹿茸抗前列腺癌的作用机制
2.1实验材料
2.1.1 数据库
BATMAN-TCM数据库，链接：http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/； Pubchem数据库，链接：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/； Genecards数据库，链接：https://www.genecards.org/； SRING数据库，链接：https://cn.string-db.org/； Metascape数据库，链接：https://metascape.org/
2.1.2 分析软件
微生信在线作图工具平台，链接：http://www.bioinformatics.com.cn/；
Cytoscape 3.8.0网络拓扑分析软件，链接：https://cytoscape.org/
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2.2方法
2.2.1 鹿茸活性成分和作用靶点的筛选
通过应用中药分子机制生物信息学分析平台BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）检索鹿茸作用靶点，并利用该服务器的“成分-靶点相似性”原理，将Select input type设置为“Herb or Herb list”关键词输入为“LU RONG”，设置“药物-靶点”相似性阀值Score cutoff≥25，选择P≤0.05对鹿茸活性成分和靶点进行预测和筛选。
2.2.2 鹿茸抗前列腺癌作用目标的预测与筛选
GeneCards（https://www.genecards.org/）是一个提供可搜索的人类基因注释的综合数据库[75]，前列腺癌的靶点可以通过设置检索词为“prostate cancer”，和“Relevance Score≥10”获得。然后筛选前列腺癌靶点和鹿茸潜在靶点的交集靶点，即鹿茸抗前列腺癌的潜在靶点。
2.2.3 鹿茸抗前列腺癌蛋白-蛋白相互作用网络的构建
将鹿茸和前列腺癌的交集靶点输入STRING（https://cn.string-db.org/）数据库，筛选条件设置为物种“智人”其余设置为默认设置，从而构建了鹿茸抗前列腺癌PPI网络[76]。使用Cytoscape3.8.1软件插件network analyzer对PPI网络中平均和最大自由度的拓扑参数进行分析。根据筛选条件：上限为最大Degree值，下限为平均度值的两倍对Degre值筛进行筛选，筛选出更有潜力的治疗靶点[77]。
2.2.4 鹿茸抗前列腺癌作用的GO富集分析和KEGG通路预测
为了进一步分析共同靶点的生物功能及在信号通路中的作用，我们采用Metascape数据处理平台[78]（https://metascape.org/）对鹿茸和前列腺癌的交集靶点进行基因本体（GO）分析和基因组学百科全书（KEGG）富集，物种和背景设置均为“Homo sapiens”（智人）进行富集分析。GO富集分析包括生物过程、细胞成分和分子功能获得基因比率（gene ratio）前20个项目。将结果输入微生信数据库（http://www.bioinformatics.com.cn/）以获得GO和KEGG富集分析的气泡图。对潜在靶点的生物学功能及参与的通路进行分析，进而明确鹿茸抗前列腺癌作用的可能药理机制。
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第三章 鹿茸蛋白联合顺铂对PC-3M细胞凋亡的影响 ................... 22
3.1 实验用品 .................................... 22
3.2 方法 ...............................22
第四章 DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合 Cis 给药对前列腺癌 PC-3M 细胞迁移及自噬的影响 .............................. 31
4.1 实验用品 .......................... 31
4.2 方法 ............................... 31
第五章 DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ通过 PI3K/AKT 通路增强 Cis 的抗肿瘤作用 .................................... 39
5.1 实验用品 ................................... 39
5.2 方法 ....................................... 40
第五章 DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ通过PI3K/AKT通路增强Cis的抗肿瘤作用
5.1实验用品
5.1.1实验材料
鹿茸蛋白DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ均为实验室自制，蛋白质纯度分别为88.09%，89.85%（分光光度法）。人前列腺癌PC-3M细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
5.1.2 实验试剂
RPMI-1640培养基，磷酸盐缓冲液（PBS），青霉素链霉素溶液（Penicillin Streptomycin Solution），0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；顺铂购自齐鲁制药有限公司；ROS检测DCFH-DA探针、兔抗人PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）均购自美国Cell Signaling Technology公司；N-乙酰半胱氨酸（NAC）、Hoechst33258染色剂、RIPA裂解液、PMSF（100mM）、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(通用型, 50X)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、增强型线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自碧云天生物科技有限公司；吖啶橙染色剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。
5.1.3实验设备
PL303电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BSG-28电热恒温水浴锅，上海惠诚生物科技有限公司；YJ-1340超净工作台，日本SANYO；CC1-170B CO2培养箱，Thermo Fisher Scientific公司；电泳装置和Tanon5200凝胶成像系统均购自上海天能科技有限公司。
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第六章 结论
明确了DAP经过分离后其蛋白组分DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ的微观结构呈现出不规则片状，结构疏松且表面不平整。其热稳定性、溶解性、乳化性及起泡性等性质均得到显著提升，丰富了鹿茸蛋白在食品、药品加工中的应用空间。
通过网络药理学技术和方法，明确了鹿茸可能通过PI3K/AKT信号通路调控细胞对有机氮化合物的反应，细胞增殖的负调控途径有关。基于网络药理学预测结果并结合联合给药增效减毒理论，我们通过体外细胞实验进行验证，结果表明，DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ单独给药及其与Cis协同给药对L02细胞、HEK293细胞均具有显著促进增殖的作用，对PC-3M细胞具有显著抑制作用，说明联合给药具有增效减毒的作用；此外，DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ及其联合Cis给药通过下调线粒体膜电位、破坏细胞形态并使细胞核碎裂、增强Bax/Bcl-2的比率，上调CytoC的表达从而诱导PC-3M细胞凋亡；通过抑制PC-3M细胞伤口愈合及诱导自噬溶酶体的产生，并且通过促进LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化，促进Beclin-1表达并下调MMP2、MMP9、VEGF、P62的表达从而抑制PC-3M细胞的迁移并诱导自噬从而抑制PC-3M细胞增殖。DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis给药效果均优于单独给予DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ及Cis组。
结合网络药理学预测鹿茸抗前列腺癌作用机制，通过ROS染色、Western blot及NAC拮抗实验进一步明确DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis对PC-3M细胞的抑制作用是基于ROS介导的PI3K/AKT信号通路发挥作用的。结果表明DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis给药后通过抑制PI3K/AKT信号通路从而抑制PC-3M细胞增殖且DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis给药效果均优于单独给予DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ及Cis组。NAC预处理后，DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis给药对PC-3M细胞的增殖抑制、诱导凋亡及自噬的调控能力均具有不同程度的减弱，说明DAP-Ⅰ、DAP-Ⅱ联合Cis给药通过ROS介导PI3K/AKT信号通路发挥抗肿瘤作用。
参考文献（略）