本文是一篇药学论文，我们发现了联苯基芳基乙炔类化合物具有 HIF-1 抑制活性，经过结构优化得到了一个活性显著的化合物 9i，通过体内外活性研究证明其具有较好抗肿瘤活性，可能与下调 HIF-1 通路下游靶基因 VEGF mRNA 的表达有关。
1 绪论
1.1 卷柏中炔酚类化合物的发现
卷柏属（Selaginella）为多年生草本植物广泛分布于我国东北、华北、华东、中南及陕西、四川等地。卷柏古时就已经被用于民间药用，《本草纲目》中记载其有止咳、止血等功效。《中国药典》2015版的一部药材和饮片章节中同样提到卷柏具有活血通经、化瘀止血等功效。几十年来，卷柏中的主要代谢产物以黄酮、苯丙烷类、和简单生物碱为代表。
Zhang 等[10]在 2007 年首次从中华卷柏中提取分离得到具有亚甲基苯醌和炔基苯酚的全新碳骨架天然产物 Selaginellin，从此激发了化学家们对卷柏中这类特殊结构化合物的研究热情。至今科学家们已经陆续从中华卷柏或垫状卷柏等卷柏属植物中分离得到了以五元苯环、四元苯环、三元苯环为主体骨架的多种类型的卷柏素类化合物[11-21]，并且对于此类化合物的研究已经从提取分离扩展到了全合成和药理活性的研究。
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1.2 炔酚类化合物的抗肿瘤活性
关于炔酚类化合物的抗肿瘤活性研究是近几年开始比较关注的方向，2012 年曹园等[30]发现 Selaginellin 在A549、BGC-823、BEL-7402 等人类癌细胞系中具有选择性的细胞毒活性。后续张国刚等[15]发现 Selaginellin 类化合物对U251、HeLa、MCF-7几种癌细胞系也有较好的抑制活性。杨超等[31]从垫状卷柏中提取得到Selaginellin O等化合物，并发现在Hela细胞中有明显的细胞毒作用。2017年，曹园等[8]报道了一种炔酚类化合物的二聚体分子 Diselaginellin B，其可抑制 SMMC7721人肝癌细胞的转移并诱导其凋亡。可以看出，目前的研究均表明此类化合物的抗肿瘤活性主要体现在其细胞毒作用上。
本课题组在先前的研究中从垫状卷柏中提取得到几种炔酚类化合物，其中以Selaginellin A为代表的几种天然产物在H322细胞种表现出较好的抑制活性，MTT法测得其IC50为9.54 μM[9]，这也与其他课题组的研究报道相一致。此外，双荧光素酶报告基因检测法表明 Selaginellin A 对低氧诱导因子-1（HIF-1）通路也具有抑制活性。
鉴于此类化合物丰富的药理活性，同时具有潜在的抗肿瘤活性，仅靠从天然产物中提取分离，获得的效率和产率总归相对低下，所以后续还进行了对此类化合物的全合成研究。在合成过程中，我们发现了以化合物 1a 为代表的类似C型卷柏素的化合物，具有较强HIF-1抑制活性和低细胞毒性，和以化合物 2h 为代表的苯乙炔取代在间位，具有较强HIF-1抑制活性的同时也有较强的细胞毒性作用的化合物。
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2 实验部分
2.1 材料与仪器
2.1.1 化学药品
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2.2 化合物5a-5m的合成
2.2.1 合成路线
合成方法主要使用两步偶联反应进行C-C键的构建来形成主体骨架，路线由化合物1起始在醋酸钯催化下使用NIS进行邻位碘代，之后经过酯化反应得到关键中间体化合物3，先后经过Sonogashira偶联、Suzuki偶联得到目标化合物5a-5m，反应过程中与之前合成方法[52]相比改变了偶联反应的顺序，大大提高了反应收率和后处理难度。
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3 结果与讨论 .......................................... 47
3.1 炔酚类似物的结构设计与逆合成分析 .......................... 47
3.2 炔酚类似物的细胞毒性和 HIF-1 抑制活性及 SAR 分析 ............................. 48
3.3 化合物9i 对 HIF-1 蛋白和VEGF mRNA表达的影响 ................................. 52
3.4 化合物9i 对 Hela 细胞迁移和侵袭的影响 .............................. 53
结论 ......................................... 57
3 结果与讨论
3.1 炔酚类似物的结构设计与逆合成分析
药学论文参考
我们之前的研究中设计并合成了一系列模拟天然炔基苯酚骨架的二芳基乙炔化合物，其中化合物1a具有较高的HIF-1抑制活性（IC50 = 10.1 μM）和相对较低的细胞毒性（IC50 > 100 μM），证明了其作为HIF-1抑制剂的巨大潜力[49]。
合成过程中首先设计了仅包含联苯或二苯乙炔部分的两个化合物以及炔键还原为双键的化合物，以探究这几个部分对活性的贡献。活性测试中发现仍然是先导化合物 1a 具有最好 HIF-1 抑制活性，说明联苯二芳基乙炔是活性必须基团，后续的改造则是基于化合物1a。
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结论
（1）设计合成了化合物 12a、b 和 13，其在 15 μM 下的 HIF-1 抑制活性均显著低于化合物 3-（4-甲氧基苯乙炔基）-4’-甲氧基-1,1’-联苯-2-羧酸甲酯（1a），这表明联苯二芳基乙炔是此类化合物必须的活性母核。后续以 1a 为先导化合物，通过三轮逐步优化，共得到 30 个化合物，其中 8 个化合物的 HIF-1 抑制活性优于 1a ，在这些化合物中以化合物 9i 表现出最佳的 HIF-1 抑制活性（IC50 = 1.5 ± 0.03 μM），与 1a 相比活性显著提高。
（2）Western Blot 实验和 qPCR 实验表明 9i 对 HIF-1α 蛋白没有影响，而可以下调下游靶基因 VEGF mRNA 的表达。通过划痕实验、侵袭实验、小管形成、克隆形成实验对 9i 进行体外抗肿瘤活性和 HIF-1 通路抑制活性研究，结果表明 9i 呈浓度依赖性降低 Hela 细胞的划痕愈合能力、侵袭能力以及小管形成能力，在 5 μM 的浓度下显著抑制 Hela 细胞的体外克隆形成。总体来说，9i 在细胞水平上可以抑制 Hela 细胞转移、侵袭和增殖。
（3）采用小鼠乳腺癌模型评估了 9i 的体内抗肿瘤能力，结果表明阳性对照白藜芦醇和化合物 9i 均表现出良好的体内抑制肿瘤生长作用，给药组肿瘤体积均小于阴性对照 PBS 组， 9i 使用剂量仅为白藜芦醇的一半而且抑制肿瘤生长作用更优，在连续给药条件下对多种器官没有显示出明显毒性。总体结果表明此类炔酚类似物有望开发成为一类新型的 HIF-1 抑制剂。
总之，我们发现了联苯基芳基乙炔类化合物具有 HIF-1 抑制活性，经过结构优化得到了一个活性显著的化合物 9i，通过体内外活性研究证明其具有较好抗肿瘤活性，可能与下调 HIF-1 通路下游靶基因 VEGF mRNA 的表达有关，但是具体的作用靶点还有待进一步研究。另外，还需要通过进一步结构优化改善该化合物的水溶性和药代动力学性质，为后续新药开发奠定基础。
参考文献（略）