辐状肋柱花乙酸乙酯萃取物化学成分及抑制肿瘤细胞增殖作用思考

本文是一篇药学论文，本实验对辐状肋柱花的化学成分和其体外抗肿瘤活性进行了系统的研究，实验结果丰富了辐状肋柱花的化学成分，筛选出抗肿瘤活性较好的单体化合物，为进一步开发利用辐状肋柱花提供了科学依据和理论基础。

第一章  绪论

1.1 肋柱花属植物化学成分研究进展
肋柱花属植物中含有丰富的化学成分，通过查阅国内外相关文献归纳出其主要含有????酮、黄酮、三萜、苯丙素、单萜以及甾醇和环烯醚萜等化学成分。
1.1.1  ????酮类化合物
????酮即苯色原酮类，是肋柱花属植物的主要成分之一。目前，国内外学者已经从肋柱花属植物中分离得到 12 个????酮类化合物，其中包括简单含氧取代????酮类（14）[3, 4]，呋喃????酮类（5）[3]，????酮苷类（611）[3, 5-7]和双????酮类（12）[5, 6]（见图 2，表 1）。 ....................

1.2  肋柱花属植物的生物活性研究进展
1.2.1  抗肿瘤作用
贾凌云等[13]采用 MTT 法对从辐状肋柱花中分离得到的 13 个????酮类化合物进行抗肿瘤活性研究，实验结果表明这 13 个????酮类化合物对人宫颈癌 HeLa 细胞、人黑色素瘤 A357-S2 细胞、人乳腺癌 MCF-7 细胞、人肝癌 HepG2 细胞及人胃癌 SGC7901 细胞均具有不同程度的抑制作用。Guo HY[14]等同样采用 MTT 法对肋柱花氯仿萃取物，正丁醇萃取物以及水层进行了肿瘤细胞毒性研究，实验结果表明这三个萃取物对人肺癌细胞 A549、人血癌细胞 K562 与人宫颈癌细胞HeLa 的增殖均有一定的抑制作用。
1.2.2  抗菌作用
孙建军等[15]以平皿钢管法测定辐状肋柱花石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位以及正丁醇萃取部位的体外抗菌活性，实验结果表明，乙酸乙酯部位为主要抗菌部位，其对大肠埃希菌、痢疾杆菌、白色葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等所代表的的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑菌活性。
1.2.3  降血脂作用
Bao  LD 等[16]研究发现，辐状肋柱花中含有的四种????酮类化合物：1-hydroxy-3,7,8-trimethoxyxanthone、1-hydroxy-3,5,8-trimethoxyxanthone、methyl swertiamarin 和 6,8-dihydroxy-1,2-dimethoxyxanthone，可缓解因摄入高果糖食物引起的高胆固醇血症和高甘油三酯血症。
1.2.4  保肝作用
Chen  RH 等[17]通过生物化学分析、组织学分析与 GC-MS 和 LC-MS 代谢组学相结合的方法综合研究了辐状肋柱花对 CCl4诱导急性肝损伤小鼠的肝保护作用，生化、组织学检测以及代谢变化的结果都表明辐状肋柱花具有潜在的肝保护 作 用 。 冯 育 林 等[18]研 究 发 现 ， 辐 状 肋 柱 花 中 含 有 的 ???? 酮 类 化 合 物1,4,8-trimenthoxyxanthone  -6-O-β-D-glucoronul-(1→6)  O-β-D-glucoside 对肝细胞内脂质的积累有显著的抑制作用。巴根那等[19]等将肋柱花、苦参、栀子、瞿麦回流提取，减压浓缩，研发出一种治疗肝炎型肝纤维化的蒙药制剂，该药物制剂相比于西药具有疗程短、疗效显著、毒副作用小等优点。
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第二章  实验材料

2.1  实验药材与实验仪器
实验用辐状肋柱花全草采集于内蒙古地区，经延边大学药学院中药与民族药学系李镐教授鉴定为龙胆科肋柱花属植物辐状肋柱花[Lomatogonium  rotatum (L.) Fries ex Nym.]，凭证标本（编号：YB-LR20181120）保存于延边大学药学院生药实验室标本库。 ......................

2.2辐状肋柱花乙酸乙酯萃取物的分离
取辐状肋柱花乙酸乙酯萃取物（239.0 g），用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（11 × 75 cm）干法上样，以石油醚-乙酸乙酯（3:1）和二氯甲烷-甲醇（20:1, 15:1, 8:1, 4:1）溶剂系统进行梯度洗脱，共得到 7 个组分（Fr.1~7）。Fr.2（20.0 g）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（6.5 × 60 cm）干法上样，以石油醚-乙酸乙酯（7:1, 5:1, 3:1, 1.5:1, 1:1）溶剂体系进行梯度洗脱，共得到 9 个组分（Fr.2-1~2-9）。Fr.2-7（2.1  g）干法上样于制备型 MPLC（C18，80  g，40-60  μm），以甲醇-水（10%~70%,  20  mL/min）进行梯度洗脱，共得到 8 个组分（Fr.2-7-1~2-7-8）。Fr.2-7-4（50.2 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇（10:1:0.2, 5:1:0.2）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物 19（5.0 mg），化合物 30（3.0 mg）。Fr.2-7-6（130.2 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇（15:1:0.2,  10:1:0.2）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物 1（20.3 mg）。Fr.2-7-8（57.0 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯（5:1, 3:1）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物12（4 mg），化合物 14（5.8 mg）。Fr.2-9（2.9 g）干法上样于制备型 MPLC（C18，80 g，40-60 μm），以甲醇-水（15%~70%, 20 mL/min）进行梯度洗脱，共得到13 个组分（Fr.2-8-1~2-8-13）。Fr.2-9-2（80.0  mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯（4:1, 2:1）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物 29（10.0 mg）。Fr.2-9-5（190.0 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50  cm）中，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇（6:1:0.3,  4:1:0.3）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物 28（5.8 mg）。Fr.2-9-6（350.0 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯（8:1, 5:1）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物2（2.4 mg），化合物 3（86.7 mg），化合物 7（6.7 mg）。Fr.2-9-13（880.0 mg）干法上样，装于正相硅胶柱（1.5 × 50 cm）中，用石油醚-乙酸乙酯（8:1, 5:1）溶剂体系进行梯度洗脱得到化合物 18（414.7  mg）。Fr.3（15.0  g）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（6.5 × 60 cm）干法上样，以二氯甲烷-甲醇（40:1, 30:1, 20:1, 15:1）溶剂体系进行梯度洗脱，共得到 6 个组分（Fr.3-1~3-6）。Fr.3-2（491.9 mg）干法上样于制备型 MPLC（C18，12 g，40-60 μm），以甲醇-水（25%~55%, 12 mL/min）进行梯度洗脱得到化合物 27（7.5 mg）和 Fr.3-2-2（142.6 mg）。
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第三章   实验方法 ................................ 10
3.1  辐状肋柱花的提取与萃取流程 .................................... 10
3.2  辐状肋柱花乙酸乙酯萃取物的分离 ................................ 11
3.3 抑制肿瘤细胞增殖作用研究 .......................... 15
第四章  结果与讨论 ...................................... 16
4.1  化合物 1 的结构鉴定 ........................... 16
4.2  化合物 2 的结构鉴定 ....................................... 18
4.3  化合物 3 的结构鉴定 ...................................... 20
第五章  结论 ........................ 81 

第四章  结果与讨论

4.1  化合物 1 的结构鉴定
化合物 1：白色无定形粉末，分子式为 C20H22O6，[α]25D  +25.42 (c 0.14, MeOH)，分子量为 358.14。 1H-NMR (300 MHz, methanol-d4)谱显示:  苯环上的 6 个氢质子信号 δH (ppm) 6.93 (2H, d, J = 1.2 Hz, H-2, 2′), 6.80 (2H, dd, J = 8.2, 1.2 Hz, H-6, 6′), 6.75 (2H, d, J = 8.2, H-5, 5′),  由此推断，两个苯环为 ABX 体系, 2 个被氧化的次甲基氢质子信号 δH  (ppm)  4.69  (2H,  d,  J  =  4.2  Hz,  H-7,  7′),  2 个被氧化的亚甲基氢质子信号 δH (ppm) 4.18-4.21 (2H, m, H-9a, 9'a), 3.80 (2H, m, H-9b, 9′b), 2 个甲氧基氢质子信号δH (ppm) 3.83 (6H, s, 3, 3′-OCH3), 2 个次甲基氢质子信号 δH (ppm) 3.10-3.13 (2H, m, H-8, 8′)。
13C-NMR  (75  MHz,  methanol-d4)谱共显示 20 个碳信号,  包括两个苯环上的碳信号 δC (ppm)  149.1  (C-4,  4′),  147.3  (C-3,  3′),  133.8  (C-1,  1′),  120.0  (C-6,  6′), 116.1 (C-5, 5′), 111.0 (C-2, 2′), 2 个被氧化的次甲基碳信号 δC (ppm) 87.5 (C-7, 7′), 2 个被氧化的亚甲基碳信号 δC (ppm)  72.6  (C-9,  9′),  2 个甲氧基碳信号 δC (ppm) 56.4 (3, 3′- OCH3), 2 个次甲基碳信号 δC (ppm) 55.3 (C-8, 8′)。
结合旋光度与 C-7, 7′、C-1, 1′的化学位移，与参考文献[27, 28]进行对比（见表4）确定化合物 1 的相对构型为 7S、7′S，如图所示，根据1H、13C-NMR 谱数据以及参考文献[28]确定化合物 1 为(+)-pinoresinol。

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第五章  结论

1.  本研究从辐状肋柱花的乙酸乙酯层中共分离得到 30 个化合物，包括 11 个木脂素类化合物（111），7 个黄酮类化合物（1218），4 个三萜类化合物（1922），4 个环烯醚萜类化合物（2326），1 个香豆素类化合物（27），1 个倍半萜类化合物（28），1 个降碳倍半萜类化合物（29）以及 1 个单萜类化合物（30）。
2.  化合物 23 是首次从自然界中分离得到，化合物 4、611、21、22 和 2830 是首次从龙胆科植物中分离得到，化合物 13、5、14、19、20、24、25 和 27 是首次从肋柱花属中分离得到，化合物 18 是首次从辐状肋柱花中分离得到，为本植物和本属植物的分类学提供了理论依据。
3.  活性实验结果表明，在化合物浓度为 30  μM 时，化合物 7、12、14、15、19和 20 对人肺癌细胞（A549）增殖具有抑制作用；化合物 7、12、1315 和 1923对人肝癌细胞（SK-Hep1）增殖具有抑制作用；化合物 7、15、19 和 20 对人宫颈癌细胞（HeLa）增殖具有抑制作用。综合上述实验结果发现化合物 7、15、19、20 对这三种肿瘤细胞均有一定的抑制作用，其中化合物 19，20 的抑制作用最为显著，化合物 19 在人肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（SK-Hep1）和人宫颈癌细胞（HeLa）中的 IC50值分别为 20.37 ± 2.06、13.79 ± 1.23、29.14 ± 1.45 μM，化合物 20 在人肺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（SK-Hep1）和人宫颈癌细胞（HeLa）中的 IC50值分别为 29.26 ± 2.35、16.24 ± 2.09、21.34 ± 1.62 μM。本文首次报道了化合物 19 针对 SK-Hep 1 细胞的增殖抑制活性。
4.  综上所述，本实验对辐状肋柱花的化学成分和其体外抗肿瘤活性进行了系统的研究，实验结果丰富了辐状肋柱花的化学成分，筛选出抗肿瘤活性较好的单体化合物，为进一步开发利用辐状肋柱花提供了科学依据和理论基础。
参考文献（略）