本文是一篇医学论文，本研究发现FOXP3基因多态性与T2DM及T2DN的易感性具有相关性，为T2DM和T2DN的机制研究提供提供一定的理论依据和科学线索。
第一章前言
1.1糖尿病及糖尿病肾病概述
1.1.1糖尿病流行病学
医学论文怎么写
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由胰岛β细胞分泌功能障碍或靶细胞胰岛素抵抗引起胰岛素相对缺乏的慢性代谢性疾病，以持续性高血糖为主要特征，同时伴有蛋白和脂肪代谢紊乱[1]。机体长期高血糖可引起多种组织和器官的慢性损害及其功能障碍，甚至衰竭，例如肾脏、眼睛、足、心血管及神经系统等[2]。根据1999年WHO提出的糖尿病病因学分型体系，糖尿病被分为1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病共4种类型[3]。截止2021年12月，国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）发布的最新官方网络数据显示，糖尿病将是21世纪增长最快的全球紧急卫生事件之一。据估算，目前全球有5.37亿成人（20-79岁）患有糖尿病，占全世界该年龄段人口的10.5%。预计到2030年和2045年，世界糖尿病患者人数将分别增至6.43亿和7.83亿，患病率分别达到11.3%和12.2%[4]。
糖尿病的流行具有明显的特征，在疾病类型、人群及地域分布均存在显著差异。在类型上，T2DM是最多发的糖尿病类型，占90%以上，且未确诊的糖尿病患者和糖尿病前期患者人数众多[5]。在地域分布上，中东及北非患病率最高（16.2%），非洲地区最低（4.5%）。北美及加勒比地区、西太平洋、中南美洲、欧洲和东南亚地区的糖尿病患病率依次分别为14.0%、11.9%、9.5%、9.2%和8.7%。非洲（53.6%）、西太平洋（52.8%）和东南亚（51.3%）区域的未确诊糖尿病比例最高。北美和加勒比地区未确诊糖尿病的比例最低（24.2%）。据预测，在2010年至2030年期间，发达国家的成人糖尿病患者数量将增加20%，发展中国家将增加69%。在人口分布特征上来看，20-24岁人群的患病率最低，为2.2%；在75-79岁的成年人中，患病率约为24.0%。20-79岁成人中，女性的糖尿病患病率略低于男性（10.2%vs.10.8%），该性别差异同样也存在于工作年龄阶段（20-69岁）的糖尿病患者人群。此外，约2/3糖尿病患者生活在城市地区，城市人口患病率（12.1%）高于农村地区（8.3%）。随着城市化进展和人口老龄化，预计2045年城市人口中的糖尿病患病率将达到13.9%。同时，糖尿病也是全球主要死因之一。2021年，全球约670万人死于糖尿病或其并发症，占该年龄组所有死亡的12.2%，相当于每5秒钟就有1人死亡。
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1.2代谢性炎症和胰岛素抵抗
1.2.1代谢性炎症（metaflammation）
随着经济快速发展和人民生活水平的日益提高，超重/肥胖、2型糖尿病、高血压、高脂血症、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)、动脉粥样硬化等慢性代谢性疾病的患病率不断攀升。由人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱引起的一系列复杂的代谢紊乱症候群统称为代谢综合征（Metabolic syndrome，MetS)[35,36]。其病因及发病机制仍未完全阐明，初步研究表明主要是由遗传因素、环境因素、高热量及久坐的生活方式共同作用所致[37]。其中胰岛素抵抗（insulin resistance,IR)是MetS的重要病理基础[38]。胰岛素作为一种由胰腺β细胞为响应高血糖而分泌的肽激素，它可通过抑制脂肪分解和肝糖异生来发挥其合成代谢作用，同时增加肝脏，肌肉和脂肪组织中的葡萄糖摄取[39,40]。当机体发生IR时，靶细胞对胰岛素的代谢敏感性降低或者机体内循环（或注射）的胰岛素降低血糖的作用受损[41,42]。例如脂肪组织中发生IR时，胰岛素介导的脂肪分解抑制受损。由此导致的循环游离脂肪酸（FFAs）增加，同时引起多种器官（如骨骼肌、肝脏、胰岛、下丘脑等）中胰岛素信号级联反应的改变，从而形成加剧胰岛素抵抗恶性循环[43,44]。
在早先研究中，人们认为代谢和免疫是两个独立的过程。在1990年，Berk等首次观察到冠状动脉疾病过程中C反应蛋白水平升高[45]。不久后，Hostamisligil等人发现肿瘤坏死因子α（TNFα)在肥胖小鼠的附睾脂肪中过度表达，并且TNFα的中和可改善肥胖相关的胰岛素抵抗[46]。自此以后，巨噬细胞介导的与肥胖相关的炎症被确定为多种代谢性疾病（包括T2DM、IR、冠状动脉疾病和脂肪肝疾病)发生和进展的核心参与者[47-49]。2006年，Hotamisligil首次提出“代谢性炎症”(metaflammation)在MetS中发挥关键作用[50]。研究发现，体内饱和游离脂肪酸（FAA）的升高通过Toll样受体（TLR）信号传导和含有NLRP3(NLR family pyrin 在早先研究中，人们认为代谢和免疫是两个独立的过程。在1990年，Berk等首次观察到冠状动脉疾病过程中C反应蛋白水平升高[45]。不久后，Hostamisligil等人发现肿瘤坏死因子α（TNFα)在肥胖小鼠的附睾脂肪中过度表达，并且TNFα的中和可改善肥胖相关的胰岛素抵抗[46]。自此以后，巨噬细胞介导的与肥胖相关的炎症被确定为多种代谢性疾病（包括T2DM、IR、冠状动脉疾病和脂肪肝疾病)发生和进展的核心参与者[47-49]。2006年，Hotamisligil首次提出“代谢性炎症”(metaflammation)在MetS中发挥关键作用[50]。研究发现，体内饱和游离脂肪酸（FAA）的升高通过Toll样受体（TLR）信号传导和含有NLRP3(NLR family pyrin
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第二章 材料与方法
2.1研究对象
研究对象来自2021年3月至2022年4月就诊于兰州大学第二医院且住院的2型糖尿病患者（T2DM组）200例，其中男性患者115例，女性患者85例；2型糖尿病肾病患者（T2DN组）200例，其中男性患者144例，女性患者56例；收集来自体检中心的健康对照组（HC组）200例，其中男性患者97例，女性患者103例。上述三组受检者均来自无亲缘关系的甘肃省兰州地区的汉族人群，且严格按照纳入排除标准选择符合条件的患者标本，共计600例。
2.1.1纳入标准
T2DM组：
（1）患者年龄≥40岁，籍贯为甘肃省；
（2）符合《中国2型糖尿病防治指南》（2020年版）中T2DM的诊断标准（典型糖尿病症状加上随机血糖≥11.1 mmol/L；或加上空腹血糖≥7.0mmol/L；或加上OGTT 2h血糖≥11.1 mmol/L；或加上HbA 1c≥6.5%）。
T2DN组：
（1）患者年龄≥40岁，籍贯为甘肃省；
（2）符合《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》T2DN的诊断标准（随机尿UACR≥30 mg/g和/或eG FR<60ml min-1（1.73m2）-1或24h尿蛋白定量≥300mg/d）。
HC组：
（1）年龄≥40岁，籍贯为甘肃省；
（2）无典型糖尿病症状；
（3）空腹血糖<6.1mmol/L且糖负荷后2h血糖<11.1mmol/L；
（4）随机尿UACR<30 mg/g且eG FR≥60ml min-1（1.73m2）-1）。
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2.3实验方法
2.3.1标本收集与保存
所有实验标本均通过HIS系统（兰州大学第二医院），严格按照纳入排除标准分别选择符合条件的实验组（T2DM组、T2DN组）与对照组（HC组）作为研究对象，进一步根据LIS系统（兰州大学第二医院检验医学中心）查找研究对象对应的血常规标本。共收集每个研究对象的EDTA外周静脉抗凝血2管，每管约1ml，经过详细编号后，两份分别置于-20℃低温冰箱和-80℃冰箱备用。
2.3.2一般临床资料及生化指标的收集
通过HIS系统收集研究对象的年龄、性别、体重指数（BMI）、发病年龄、T2DM病程和相关生化指标进行分析，后者包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、空腹血糖（FBS）、午餐后血糖（PLBS）以及尿素和血清肌酐。该研究获得兰州大学第二医院伦理委员会批准（编号为2021A-255）。
2.3.3 EDTA抗凝静脉血DNA提取
该研究按照血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书对研究对象EDTA抗凝血中的DNA进行提取，具体步骤如下：
（1）将分装好的一份新鲜血液标本（-20℃)先放入4℃冰箱进行缓慢解融。
（2）对解融的血液进行涡旋震荡并瞬离，后吸取200μl至干净的EP管（做好标记）中；加入20μl蛋白酶K（Proteinase K）溶液，充分颠倒混匀（盖紧管盖），简短离心以去除管盖内壁的残留。
（3）加入300μl的裂解液CL（Cell Lysis），颠倒混匀，以10000 rpm/min离心1 min，弃上清后再加入相同体积的裂解液CL，使其充分裂解。
（4）加入200μl的缓冲液GB，使用涡旋振荡器充分混匀。
（5）在70℃的恒温金属浴中放置10 min，每隔2-3分钟混匀一次，共混匀3-4次，直到管内的溶液变清亮后再进行简短离心。
（6）加入200μl的无水乙醇，使用涡旋振荡器使其充分震荡混匀，管内出现白色絮状沉淀后简短离心。
（7）准备试剂盒自带的吸附柱及收集管（吸附柱加入收集管中），并做好样本标记；将第（5）步得到的所有溶液（包括絮状沉淀）均转移至试剂盒自带的吸附柱CB3中（拿取吸附柱时尽量避免接触底部），10000 rpm（~13400×g）离心30 s，弃废液，并将吸附柱CB3重新放回收集管中。
（8）加入缓冲液GD 500μl（注意：使用前参照瓶身标签加入相应体积的无水乙醇），12000 rpm（~13400×g）离心30 s，并将吸附柱CB3重新放回收集管中。
（9）加入漂洗液PW 600μl（注意：使用前参照瓶身标签加入相应体积的无水乙醇），12000 rpm（~13400×g）离心30 s，弃掉废液后将吸附柱CB3放回收集管中。
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第三章实验结果..........................23
3.1一般临床资料....................................23
3.2 FOXP3基因多态性分型...........................24
第四章讨论.............................49
4.1 FOXP3基因rs3761548 C>A..............................50
4.2 FOXP3基因rs2294021 C>T...............................52
第五章结论.....................56
第四章 讨论
4.1 FOXP3基因rs3761548 C>A
FOXP3基因rs3761548位点存在C＞A突变，在健康对照组和病例组、T2DM组和T2DN组中其基因型和等位基因分布频率均具有统计学差异（P=0.005，P=0.004；P<0.001，P<0.001），这提示我们基因型AA、等位基因A可能是T2DM及T2DN的危险发病因素。显性模式[CC vs(CA+AA)]和隐性模式[AA vs(CC+CA)]可能分别是患有T2DM和T2DN的保护和危险因素。一项来自四川泸州地区汉族人群的研究结果显示，T2DM组（AA+AC）的基因型构成比明显高于对照组，提出了该位点单核苷酸多态性可能与T2DM的发生有一定关系。来自南印度人群中的研究结果表明，该位点的AA基因型使得T2DM（OR=2.41，95%CI=1.67-3.49;p<0.0001）及T2DN（OR=2.16，95%C.I=1.45-3.24;p<0.005）的发病风险增加了2倍。在中国兰州汉族人群中，AA基因型使得T2DM（OR=4.897，95%CI=2.398-10.003;p<0.001）及T2DN（OR=4.030，95%CI=2.272-7.151;p<0.001）的发病风险分别增加约5倍和4倍，而CC基因型可能为患T2DM（OR=0.530，95%CI=0.354-0.791;p=0.002）及T2DN（OR=0.648，95%CI=0.425-0.987;p=0.043）的保护因素。与T2DN组患者相比，CA基因型对于T2DM患者进展为T2DN可能发挥了一定的保护作用（OR=0.422，95%CI=0.232-0.768;p=0.005）。然而，Zavattari等人在撒丁岛人群中并未观察到该SNP位点多态性与T1DM具有相关性[133]。但是Misra等人报道了印度人群中突变等位基因A在终末期肾病临床结局和肾移植存活中的作用[134]。Park等人研究表明，韩国人群中突变基因型AA与肾脏的低移植存活率和原发性肾脏疾病的复发有相关性[135]。此外，一项在中国人群中的研究发现携带基因型AA和CA的患者发生他克莫司诱导的急性肾毒性的风险比携带纯合基因型CC的患者高10倍，这提示该SNP位点多态性可能作为预防他克莫司毒性的生物标志物，从而有助于患者进行个体化治疗[136]。该多态性位点也同样增加了中国汉族人群中患有溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)的风险，且在携带AA基因型的结肠组织中发现FOXP3表达降低[137]。Zheng等人曾报道rs3761548位点的突变不仅使Graves病（Graves'disease，GD）的患病风险增加，还可导致FOXP3启动子的相对荧光素酶活性降低、GD患者的FOXP3 mRNA表达降低[138]。
医学论文参考
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第五章 结论
1.FOXP3基因rs3761548（C>A）、rs2294021（C>T）、rs2232365（G>A）、rs3761547（T>C）4个基因多态性位点可能与中国甘肃省汉族人群中T2DM及T2DN的疾病易感性相关。FOXP3基因rs3761548（C>A）和rs2232365（G>A）位点的等位基因A均可能增加T2DM的患病风险，rs2294021（C>T）的等位基因T可能增加T2DM患者发展为T2DN的风险。FOXP3基因rs3761548（C>A）、rs2294021（C>T）、rs2232365（G>A）、rs3761547（T>C）4个位点间存在较弱的连锁不平衡。单倍型ACGT、ATGT、CCGC、CTAT可能为患T2DM的危险因素，而ATAT、CCGT、CTAC可能是T2DM患病的保护因素。
2.基于性别二分类，首次将FOXP3基因4个SNP位点与T2DM及T2DN的疾病易感性进行关联分析，结果显示rs3761548位点携带等位基因A、rs2294021位点携带等位基因T、rs2232365位点携带等位基因A均有可能增加男性患T2DM的风险，携带rs2294021位点等位基因T、rs3761547位点等位基因C可能增加男性T2DM患者发展为T2DN的发病风险；而携带rs2294021位点等位基因T、rs2232365位点等位基因A可能增加了女性患T2DM的风险。
参考文献（略）