第一章 绪论
1.1 疟疾与疟原虫
疟疾是由感染疟原虫而引起的严重危害人类健康的传染病。目前已知能够寄生于人类的疟原虫共有五种，分别是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodiumvivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）、卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）。这些疟原虫蚊虫和人两个宿主，包括蚊体内的有性繁殖和人体内的无性增殖，携带疟原虫的按蚊通过叮咬人而传播，分布遍及全球，主要流行于热带和温带的发展中国家。
1.1.1 疟疾的流行现状
据 2020 年世界疟疾报告报道，2019 年全球疟疾新发病例达 2.29 亿，涉及了全球 87个国家和地区。疟疾病例目前仍然主要集中于非洲地区，在 2019 年非洲地区有 2.15 亿例病例，约占总病例的 94%，东南亚地区约占 3%，其余则分布在东地中海地区、西太平洋地区及美洲。孕妇仍然是感染疟疾的高危人群，在疟疾流行率较高的 33 个国家中，2019 年估计有 3300 万人怀孕，其中 35%（1200 万）在此期间感染疟疾，导致了 82.2万名低出生体重儿童的出生。在疟疾死亡病例中，5 岁以下儿童是全球死亡率最高的群体，占据着全球死亡病例的 67% [1]。
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1.2 疟原虫的免疫逃避机制
在能够感染人类的五种疟原虫中，恶性疟原虫占据着绝大部分的比例，其所导致的恶性疟约占人类感染疟疾总病例数的 94%，且对人体危害最为严重，致死率也最高。而间日疟原虫则是在除非洲以外地区分布最广的疟原虫，由间日疟原虫感染引起的间日疟约占疟疾总病例数的 6%。由于其余感染人类的三种疟原虫所引起的病例数较少，且对人体危害较轻，本部分不做讨论，仅对恶性疟原虫以间日疟原虫的免疫逃避机制做进一步阐明。
1.2.1 恶性疟原虫的免疫逃避机制
对于恶性疟原虫，其之所以能够实现对宿主的免疫逃避，是因为其具有抗原变异功能的变异基因家族。如环状体期表达的 var 基因，早期滋养体期表达的 rif（repetitiveinterspersed family）基因和成熟裂殖体期表达的 stevor（subtelomeric variable open readingframe）基因，这种变异基因家族在红内期的排他性表达在恶性疟原虫的免疫逃避过程中发挥了关键作用。
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第二章 PvTRAgs重组蛋白的表达及亚细胞定位
2.1 引言
间日疟原虫输出蛋白在间日疟原虫感染红细胞后输出至红细胞膜表面，在介导受染红细胞与脾脏成纤维细胞的粘附过程中发挥着重要的作用。如由 vir 基因编码的 VIR 蛋白家族成员 VIR14 能够输出至网织红细胞表面并可以通过 ICAM-1 受体分子粘附于脾脏中的成纤维细胞，使得受染红细胞在脾脏成纤维细胞的物理屏障下免于脾脏免疫系统的清除[15]，且的确有临床病理切片显示在间日疟患者脾脏中有明显的虫体淤积现象[28]。表明了间日疟原虫输出蛋白在间日疟原虫免疫逃避过程中的重要作用。
PvTRAgs 蛋白家族作为间日疟原虫另一种主要的输出蛋白家族，拥有的 36 个成员，同样在间日疟原虫感染红细胞后输出到红细胞膜表面。虽然已有部分研究证明 PvTRAgs能够与红细胞结合并且具有高度的免疫原性，但其输出至红细胞膜表面后是否能够与人脾脏成纤维细胞结合并改变其结构与功能仍然未知。
在间日疟原虫中，通过用间日疟原虫感染猴体并进行全转录组分析鉴定了 67 个与脾脏相关的基因，这些基因在感染疟原虫后的猴子脾脏中高表达，而当猴子的脾脏被切除后无法检测到这些基因的表达，暗示了其在脾脏免疫调控过程中的重要作用。在这 67个脾脏依赖性基因中，有 5 个为 PvTRAgs 蛋白家族成员，分别为 PvTRAg15，PvTRAg23，PvTRAg25，PvTRAg28 和 PvTRAg32。为了更精准靶向 PvTRAgs 蛋白家族在间日疟原虫免疫逃避过程中功能作用的研究，我们选取了 PvTRAg23 作为本次研究的主要靶标抗原，同时选取了其家族成员之一的 PvTRAg26 蛋白作为同型对照。本章主要通过基因合成，蛋白表达与纯化成功构建了 PvTRAg23 与 PvTRAg26 重组蛋白，并对其进行了亚细胞定位与表达分析，为后续实验的开展奠定了基础。
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2.2 实验材料
2.2.1 实验试剂的配置
（1）LB 液体培养基：将 2g 的胰蛋白胨，1g 的酵母提取物，2g 的氯化钠加入 200mL的双蒸水中，高压灭菌，待冷却至室温后加入 200μL 的 5% Kana 溶液，混匀后置于 4℃保存备用。
（2）LB 固体培养基：将 2 g 的胰蛋白胨、1g 的酵母提取物、2g 的氯化钠、3g 的琼脂糖粉末分别加入 200mL 的双蒸水中，高压灭菌。待冷却至 55℃-65℃时加入 200μL的 5% Kana 溶液。混匀后在酒精灯旁将其倒入培养皿中，静置冷却，待其凝固后封口置于 4℃保存备用。
（3）10×SDS-PAGE 电泳液：将 10g 的 SDS 粉末、144g 的 Glycine 粉末、30.4g 的Tris 粉末加入到 980 mL 的双蒸水中，不断搅拌使其溶解，待其完全溶解后定容至 1 L，室温保存备用。
（4）考马斯亮蓝染色液：将 45 mL 的无水甲醇、10 mL 的冰醋酸加入到 450 mL 的双蒸水中，加入 0.25 g 的考马斯亮蓝 R250，搅拌混匀。待完全溶解后置于 4℃冰箱避光保存备用。
（5）考马斯亮蓝脱色液：将 50 mL 的无水乙醇、100 mL 的冰醋酸加入到 850 mL的双蒸水中，充分混匀，混匀后置于室温，保存备用。
（6）20×PBS 洗涤液：称取 160g 氯化钠，4g 氯化钾，60gTris 粉末加入 800mL 双蒸水中，完全溶解后定容至 1000mL，室温保存备用。
（7）1×PBST 洗涤液：将 50mL20×PBS 洗涤液加入到 1950mL 的双蒸水中，再加入 2mL 的吐温 20，充分混匀，室温保存备用。
（8）免疫印迹封闭液：将 5 g 的脱脂奶粉加入到 100 mL 的 1×PBST 溶液中，搅拌混匀至其完全溶解，室温保存备用。
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第三章 PvTRAg23 对 HSF 细胞的作用........................15
3.1 引言.......................15
3.2.1 细胞株..........................................15
3.2.2 实验试剂.......................................15
3.2.3 实验仪器.........................................16
3.2.4 实验试剂的配置..............................16
第四章 PvTRAg23 降低 HSF 细胞中Ⅰ型胶原表达的信号转导机制...................................30
4.1 引言....................................30
4.2 实验材料.................................30
主要结论与展望.................................38
第四章 PvTRAg23降低HSF细胞中I型胶原表达的信号转导机制
4.1 引言
胶原蛋白是成纤维细胞细胞外基质的重要组成部分，且由于其生物力学特性，在组织和器官发育、细胞迁移、增殖和分化、伤口愈合、组织重塑和动态平衡方面发挥着重要作用。而 90%以上的胶原由 I 型胶原构成，在上一章节中 PvTRAg23 蛋白能够明显降低 HSF 细胞中 I 型胶原的表达与分泌，但其中涉及的信号转导机制仍然未知。有大量研究发现人体内 I 型胶原的降解与 NF-κB 信号通路的激活有关[42, 43]。NF-κB 于 1986 年首次被描述为 B 细胞免疫球蛋白κ轻链转录所必需的核因子，在免疫反应、细胞凋亡和细胞生长中发挥积极作用，并参与多种疾病，如关节炎和癌症等[44, 45]。关于 NF-κB在 I 型胶原表达调控中的作用，特别是对人 COL1A1 基因的调控作用，目前研究很少；有研究表明，TNF-α能增加 NF-κB 的活性，下调 COL1A1 的表达[46]。
为了明确人脾脏成纤维细胞中胶原的降低是否与 NF-κB p65 信号通路相关，本章通过验证 NF-κB p65 信号通路的激活情况及抑制后胶原的表达情况进行验证。同时验证了其他信号通路如 MAPK 通路中关键蛋白 ERK、FAK 和 p38 的磷酸化情况以阐明是否有其他信号通路也参与了胶原的降低。以此来阐明胶原在人脾脏成纤维细胞中表达降低的具体信号转导机制。
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主要结论与展望
主要结论
本文以 PvTRAg23 为研究对象，考察了其对人脾脏成纤维细胞的作用，并以此探讨了其在间日疟原虫感染过程中潜在的功能与作用，主要结论如下。
（1）PvTRAg23 与 PvTRAg26 蛋白分布于间日疟原虫感染的红细胞膜表面。
（2）PvTRAg23 蛋白能够与 HSF 细胞结合，且 HSF 细胞膜表面的 Vimentin 蛋白为PvTRAg23 与 HSF 细胞结合的一个受体分子。
（3）PvTRAg23 蛋白能够诱导人脾脏成纤维细胞定向迁移。
（4）PvTRAg23 能够特异性降低 HSF 细胞中 I 型胶原的表达分泌。
（5）NF-κB p65 信号通路介导了 PvTRAg23 引起的 HSF 细胞中 I 型胶原的降低；同时 PvTRAg23 诱导的促炎性因子 IL-1β，IL-6，TNF-α的分泌正反馈调节 PvTRAg23 引起 HSF 细胞中 I 型胶原的降低。
参考文献（略）