本文是一篇农业论文，本研究成功开发了一种新型鳗鲡爱德华氏菌亚单位疫苗的表达系统，即通过枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示其外膜蛋白A(OmpA)，并采用非注射的新型浸泡免疫方式，实现了对日本鳗鲡的免疫保护。
第1章引言
1.1爱德华氏菌的致病性与致病因子
我国大陆1972年开始养殖鳗鲡，目前已形成从鳗苗捕捞、鳗鲡养殖、加工、出口贸易等配套服务产业链，成为世界上最大的养鳗国[1]。随着鳗鲡集约化养殖过程中水质环境和气候条件等因素的变化，鳗鲡养殖出现以细菌性疾病为主的多种病害，其中常见的细菌性病原菌有鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)[1]和哈维氏弧菌(Vibrio vulnificus)等[2]，这些细菌感染后常导致鳗鲡大量死亡，制约了鳗鲡产业的集约化养殖与发展。近年来对鱼类主要病原菌所引起疾病的研究逐渐增多，其中对爱德华氏菌平凡的预防和治疗也成为水产养殖业的研究热点之一，这些研究成果将为鱼类集约化养殖过程中科学有效地预防相关的疾病提供有价值的参考。
1.1.1爱德华氏菌的分类与致病性
鳗鲡爱德华氏菌(E.anguillarum)属肠杆菌科的爱德华菌属(Edwardsiella)，具周鞭毛，革兰氏阴性，最适生长温度为37℃，在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板37℃培养14-18h后可长出直径为0.5-1 mm、光滑、圆整、灰白色的菌落。2017年以前，爱德华氏菌属由4个种组成，分别为迟缓爱德华氏菌(E.tarda)、保科爱德华菌(E.hoshinae)、鲶鱼爱德华菌(E.ictururi)和杀鱼爱德华氏菌(E.piscicida)[3]。2017年，Reichley等人将部分从患病鳗鲡分离的、被命名为迟缓爱德华氏菌的细菌菌株重新命名为鳗鲡爱德华氏菌(E.anguillarum)[4]。近年来，本课题组研制了多种鳗鲡病原菌的基因工程亚单位疫苗，结果发现鳗鲡爱德华氏菌的外膜蛋白A(OmpA)具有良好免疫原性。在此基础上，我们鉴定出3个OmpA的B细胞线性表位[5]，从为OmpA的免疫机制研究提供了参考依据。
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1.2爱德华氏菌病的疫苗研究
目前国际上主要依靠抗生素治疗迟缓爱德华氏菌病，如磺胺类药物和四环素等；国内则使用氧氟沙星或庆大霉素治疗迟缓爱德华氏菌病[70]。然而，抗生素药品的不合理使用破坏了养殖环境的生态平衡，化学消毒剂及抗生素等传统的防治药物的普遍使用也增加了耐药性细菌的生存机率[71]，导致疾病爆发的恶性循环。因此，人们研究和开发疫苗以代替使用化学药物和抗生素。疫苗作为抗原被接种到生物体内后，可诱导生物体自身的免疫系统产生免疫反应，从而保护生物体免受病原菌或者病毒伤害。传统疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，新型的疫苗有DNA疫苗和重组亚单位疫苗等，已有不少关于爱德华氏菌病疫苗的相关报道，这些研究促进了水产养殖业的绿色发展。
1.2.1传统疫苗
灭活疫苗指通过加热或使用化学试剂（通常是福尔马林）将全细菌失活，但仍然保留其免疫原性。早期的研究表明，迟钝爱德华氏菌灭活菌体细胞、细胞碎片和LPS等均具有较好的免疫保护作用，可提高鳗鲡抵抗迟钝爱德华氏菌感染的能力[72]。革兰氏阴性细菌的细胞外膜主要成分通常为表面抗原，具有良好的免疫原性。全菌灭活疫苗的血清特异性免疫应答明显、免疫保护力强，而且制备方法简便、易行。目前为止，己有许多关于爱德华氏菌属灭活疫苗的研究报道。张丽等用迟缓爱德华氏菌福尔马林灭活疫苗对大菱鲆进行免疫，采用浸泡和注射两种免疫接种方法，获得的免疫保护率(RPS)分别为70％和35％[73]。Sunyun单独用迟缓爱德华氏菌福尔马林灭活疫苗免疫牙鲆时，两个月后牙鲆对迟缓爱德华氏菌的免疫保护率仅为33.3%[74]。灭活疫苗中的保护性抗原在灭活处理过程中有被破坏而导致免疫效果不理想的可能性；而且在制备过程中存在复杂的微生物产物混合体，可能引起抗原的竞争性免疫而无法激起强烈的免疫反应。
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第2章枯草杆菌重组芽孢表面展示OmpA浸泡免疫日本鳗鲡后的保护效果
2.1前言
鳗鲡养殖常出现细菌性疾病为主的多种病害，其中鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiellaanguillarum)是导致日本鳗鲡(Anguilla japonica)出现出血性败血症的最常见病原菌，感染后常引起养殖的日本鳗鲡大量死亡并造成巨大的经济损失[111]。受鳗鲡爱德华氏菌感染的养殖鳗鲡表现出包括头部发红、肝脏肿大、胸鳍、臀鳍和腹鳍充血和发红的典型症状[112]，且组织学病变集中在肝脏和肾脏[113]，表现为肝脏严重出血、肝细胞萎缩和肝血管内的血栓形成[114]。随着抗生素和化学治疗的使用逐渐受到限制，开发具有应用价值的疫苗已成为有效预防爱德华氏菌病的新方法。近年来，外膜蛋白(Omp)的免疫原性与相关的疫苗研究已成为革兰氏阴性菌疫苗研究的热点[115]，鱼类免疫嗜水气单胞菌[116]、鳗弧菌和哈维氏弧菌[117]等重组表达的外膜蛋白均可获得较好的免疫保护效果，表明以基因工程技术获取的细菌重组亚单位疫苗具有良好的免疫原性。我们之前的研究结果表明，大肠杆菌重组表达并纯化的鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A(OmpA)腹腔注射日本鳗鲡后，采用鳗鲡爱德华氏菌攻毒感染对日本鳗鲡的相对存活率(RPS)高达77.7%[118]，鳗鲡抗该菌感染的机制与lncRNA的基因选择性剪接调控密切相关[119]。研究表明，细菌外膜上的OmpA与其毒力密切相关，在细菌的粘附和侵袭中起着至关重要的作用[120]。经大肠杆菌(BL21)表达的OmpA免疫鳗鲡后，可在鳗鲡血清中产生高效价的保护性抗体[116,121]。有研究表明，OmpA是爱德华氏菌属重要的保护性抗原，其免疫保护效果通常优于灭活疫苗[122]。然而，这些在体外表达的Omp需要腹腔注射(i.p.)才能获得有效的免疫，注射免疫的缺点包括成本和操作要求高，且在大型养殖场不便于推广应用。此外，在Omp疫苗中加入的弗氏佐剂可导致鱼类腹膜的慢性炎症，对鱼类健康生长和肌肉品质均能产生负面影响[123,124]，也有许多报告强调了与鱼类腹腔注射相关的明显副作用[125]。
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2.2材料与方法
2.2.1试验鳗鲡与菌株
大肠杆菌DH5α用于质粒构建，枯草芽孢杆菌工程菌(WB800N)及其质粒PDG364购自华南丰晖生物技术有限公司。鳗鲡爱德华氏菌由本实验室从患败血病的日本鳗鲡肝脏分离、鉴定和保种[5]。日本鳗鲡(Anguilla japonica)购自中国福建省福清市鳗鲡养殖场，体重约50g/尾，实验开始前预养3周。
2.2.2主要试剂及配制方法
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第3章 浸泡免疫保护鳗鲡免于鳗鲡爱德华氏菌感染的转录组学机制初步研究 ....................... 35
3.1 前言 ................................ 35
3.2 材料与方法 ............................ 36
第4章 总结与展望 .................................. 72
4.1 论文主要结果 .................................... 72
4.2 论文主要创新点 ............................ 72
第3章浸泡免疫保护鳗鲡免于鳗鲡爱德华氏菌感染的转录组学机制初步研究
3.1前言
近20年来，日本鳗鲡(Anguilla japonica)的产业发展和相关研究取得了显著进展。作为一种具有重要经济价值的鱼类，日本鳗鲡在亚洲尤其是中国和日本的饮食文化中占有重要地位，为渔业经济发展做出了重要贡献[1]。爱德华氏菌是养殖日本鳗鲡的主要细菌性病原体，常见鳗鲡受迟缓爱德华氏菌感染的相关报道[14,15]。与化学药物和抗生素相比，疫苗是一种预防爱德华氏菌病较为安全有效的方法。与传统的灭活疫苗相比，采用基因工程技术制备亚单位疫苗是近年来疫苗研究的热点。有研究者表达并纯化鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A(OmpA)，然后腹腔注射日本鳗鲡后发现，与对照组相比，外膜蛋白疫苗组的相对存活率(RPS)为77.7%[14]。作为研究基因表达的重要手段，转录组测序技术在鱼类抗病与疫苗保护机制研究方面具有重要价值。通过对感染特定病原体的鱼类进行转录组学分析，可以识别感染过程中宿主基因表达差异，这些差异基因可能参与了免疫应答或抗病原体入侵的相关调控机制[172]。转录组学测序与分析技术还被用于探讨研究鱼类疫苗接种后的免疫应答相关机制。通过比较接种疫苗前后的鱼类转录组数据，能够帮助我们理解疫苗刺激鱼类的免疫应答过程，并探讨攻毒后哪些基因或通路在免疫保护过程中起关键作用[173]。
在日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)中探讨CXCL10在免疫防御中的作用，发现CXCL10在多种组织中表达，并在细菌感染后上调表达；重组PoCXCL10能够诱导日本牙鲆外周血白细胞(PBLs)的迁移，并抑制迟缓爱德华氏菌和其他细菌的生长，表明CXCL10在抗细菌免疫防御中有重要作用[174]。以迟缓爱德华氏菌和大肠杆菌的OmpA组成的多价DNA疫苗免疫斑马鱼后，结果显示该疫苗可显著提高IL-1,IL-6,IL-8,C3b,d和NF-kB基因的转录组表达水平[175]。此外，采用转录组分析揭示了鱼类在遭受特定疾病应激时的基因表达变化，这有助于理解疾病发生和发展的分子机制，为疾病的预防和治疗提供重要的参考依据[176]。这些发现对鱼类抗爱德华氏菌感染的机制研究具有重要意义。尽管有关爱德华氏菌的研究很多，但其对日本鳗鲡致病性的研究很少，且未见日本鳗鲡应对鳗鲡爱德华氏菌感染的相关免疫功能与基因调控差异研究的报道。本研究在上一章发现枯草芽孢杆菌孢子表面展示OmpA浸泡免疫日本鳗鲡后具有显著保护效果的基础上，采用转录组测序技术探究OmpA浸泡免疫日本鳗鲡后抗鳗鲡爱德华氏菌感染的原因，拟从转录组学的角度分析该亚单位疫苗提供保护作用的免疫机制。
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第4章总结与展望
4.1论文主要结果
(1)本研究针对引起日本鳗鲡出血性败血症的主要病原菌——鳗鲡爱德华氏菌(E.anguillarum)构建了一种新的外膜蛋白A(OmpA)亚单位疫苗表达载体，并利用枯草芽孢杆菌(WB800N)表达系统将该菌的OmpA成功展示于其芽孢表面。
(2)首次采用枯草芽孢杆菌的芽孢浸泡免疫日本鳗鲡，并评估了这种免疫方式的保护效果。结果表明，与未免疫对照组（Con组）相比，芽孢表面展示OmpA的浸泡免疫组（WA组）对鳗鲡爱德华氏菌的攻毒的相对存活率(RPS)提高了57.9%，且WA组的相对存活率略高于鳗鲡爱德华氏菌全菌灭活疫苗浸泡免疫组（EA组，RPS为52.6%）。此外，未表达OmpA的WB800N芽孢浸泡对照组（WC组）在鳗鲡爱德华氏菌攻毒后21 d内全部死亡，表明WA组产生的保护作用与芽孢表面展示的OmpA组分直接相关。
(3)对攻毒后的日本鳗鲡头肾进行转录组学测序与DEGs分析，发现WA与Con组和WA与EA组之间均存在大量的DEGs，这些DEGs富集于GO term中的钠离子活性等功能。两个免疫组之间的DEGs主要注释于KEGG的信号转导通路，而OmpA孢子浸泡与对照孢子浸泡的DEGs主要富集于吞噬细胞、ECM与受体的相互作用和B细胞受体信号通路等。这些DEGs的GO与KEGG功能注释与富集分析一方面揭示了与对照组相比WA组产生免疫保护作用的转录组学机制，另一方面提示WA组与EA组免疫后的抗鳗鲡爱德华氏菌感染机制存在明显的差异。
参考文献（略）