本文是一篇农业论文，本研究通过不同浓度的NO供体SNP对马铃薯单节茎段进行诱导结薯处理，确定了适宜诱导结薯的SNP浓度，并对该浓度SNP诱导的匍匐茎中的结薯相关基因的表达量进行分析。
第1章 研究背景
1.1 NO参与植物细胞信号转导中的作用及其分子机制
一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一种结构简单，高扩散性的气体分子，在真核生物中起着信号分子的作用，参与广泛的生长发育进程，并且由于未配对电子的存在，它具有高度的反应性，导致各种中间体的形成[1]。NO信号传导主要通过两个过程发生：一个是NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（Soluble guanylate cyclase，sGC），产生二级信使环鸟苷磷酸（Cyclic guanosine monophosphate，cG MP）；另一种是蛋白质的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），主要是通过对蛋白质中的酪氨酸残基进行硝化或半胱氨酸残基（Cysteine residues，Cys）进行S-亚硝基化（S-nitrosation，SNO）[2]。两个NO信号转导过程中最重要的是SNO[3]。在植物中，NO参与的过程包括调节气孔关闭、抑制开花、抑制某些酶的活性、激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路途径、调节细胞周期基因的表达、导致花粉管重定向、减少种子休眠并刺激萌发、乙烯的合成和信号传递、苯丙素途径、蛋白质抗氧化机制、光合作用、细胞运输、细胞死亡和其他基本代谢过程、柱头识别花粉时的生殖机制等[4-15]。此外，NO还与细胞内的其他第二信使互作，如NO能够诱导cG MP水平升高[7]，并提高胞质游离Ca2+水平，这可能是其信号转导机制的一部分[16, 17]。
除了非酶促途径合成NO外，几种蛋白质也参与催化NIT还原生成NO的过程。NO的酶促合成与一种被称为硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）的多功能细胞质酶有关[23]。这种酶也参与氮的同化和代谢，它催化氮同化的第一个限速步骤，包括利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide_reduced，NADH）将硝酸盐还原为NIT，随后NIT继续被NR还原为NO，这种活性可以被钨酸盐抑制，这种方法可用于评估NR在潜在信号通路中的参与程度[24]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中含有两个NR基因：AtNIA1和AtNIA2，它们产生的蛋白质非常相似（在氨基酸水平上相似度为83.5%），研究利用双突变体nia1&2，证实了NR参与脱落酸（Abscisic acid，ABA）诱导保卫细胞产生NO的过程[25]。对突变体nia1和nia2的比较研究表明，尽管AtNIA1在叶片中的表达水平远低于AtNIA2，但在保卫细胞中对NO生成影响最大的NR是由AtNIA1编码的[24]。
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1.2 马铃薯结薯过程中的影响因素及其分子机制
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是继小麦、水稻之外的世界第三大粮食作物[146]。它是一种富含碳水化合物且脂肪含量低的食物，其在单位土地和时间内所提供的糖类、蛋白质、矿物质以及维生素超过了其他任何作物[147]。马铃薯块茎的维生素C含量特别高，同时也是几种维生素B和钾的良好来源，马铃薯的果皮提供大量膳食纤维，并且马铃薯块茎中的许多化合物还有抗氧化活性[148]。除了可以鲜食之外，马铃薯还可以通过工业加工成许多商品，如薯片、酒精、淀粉、动物饲料等[149, 150]。马铃薯的结薯性状吸引了研究人员的广泛关注，马铃薯块茎是由地下匍匐茎的膨大形成而来的，是一个匍匐茎由伸长生长转变为径向生长的过程，这是一个复杂的发育过程，涉及到了环境因素、激素以及遗传因子的多重互作[151, 152]。
1.2.1 影响结薯的主要环境条件
马铃薯起源于南美洲的安第斯山脉的冷凉地区，众多环境因子中，温度和光照无疑是对马铃薯结薯影响最大的。
1.2.1.1 温度对结薯的影响
大多数马铃薯品种对于温度具有高度敏感性，所以温度被认为是影响马铃薯产量的最不可控因素[153]。匍匐茎的最适生长温度为25℃[154]，稍微高一点的土壤温度并不会影响匍匐茎的生长，在高土壤温度中生长的匍匐茎会向上生长，直至接触到土壤表面的低温空气，但高土壤温度会影响匍匐茎从营养生长转变为薯块膨大[155, 156]。结薯产量最好的平均日温范围是14~22℃[157]，而夜晚温度在17℃时被认为最适合薯块生长和发育的，当夜晚温度高于17℃时，能够促进马铃薯植株的地上部分营养生长，降低薯块产量[158-160]，而当夜温超过25摄氏度时，结薯过程则被完全终止[161]。
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第2章 外源NO供体硝普纳对马铃薯的结薯效应及分子机制
2.2 材料和方法
2.2.1 试验材料
植物材料：本实验所用到的二倍体马铃薯材料（CIP 705079）由国际马铃薯中心（International Potato Center，CIP）提供，所有的野生型以及转基因组培苗均采用MS培养基（4.43 g·L-1 MS粉末、30 g·L-1 蔗糖和8 g·L-1琼脂，pH=5.8）进行培养。培养条件为温度（24±1）℃，光照强度为2 000—3 000 lx，16 h光照，8 h黑暗。
带有增强绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）的CRISPR/Cas 9敲除载体：pKSE402（从马铃薯科学研究院获得）
构建CRISPR/Cas 9双靶敲除载体的中间载体：pCBC-DT1T2（从马铃薯科学研究院获得）
菌株；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105（华越洋，北京）, 发根农杆菌(Agrobacterium rhizobiaceae) Ar.Qual（唯地，上海），大肠杆菌感受态Trelief ™ 5α（擎科，北京）。
2.2.2 试验试剂
DNA聚合酶（Green Taq Mix，诺唯赞，南京） 克隆测序载体（pBM16a Topsmart kit，诺唯赞，南京） 同源重组酶（ClonExpress® MultiS One Step Cloning Kit，诺唯赞，南京） 高保真酶（primer star） 限制性内切酶BsaI（NEB，英国） MS培养基（Caisson Labs，美国） 蔗糖（国药集团，上海） 琼脂（国药集团，上海） 氢氧化钾（国药集团，上海） 蛋白胨（OXOID，America） 酵母提取物（OXOID，America） 氯化钠（国药集团，上海） 特美汀（TMT，麦克林，上海）
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2.3 结果与分析
2.3.1 硝普纳诱导马铃薯结薯适宜浓度的确定
对五组经过SNP处理的单节茎段的结薯情况进行统计，图2.1A为不同SNP处理浓度下，茎段分别在14天和28天的结薯情况，在第28天对结薯情况进行统计。可以看出，当SNP浓度为0.25 ｍM的时候结薯的个数达到最大（图2.1B），结薯数量显著多于其他处理的单节茎段，随着SNP浓度的升高，结薯数量呈下降趋势，且当SNP浓度大于0.75 ｍM的时候，茎段在腋芽处不生长匍匐茎直接长出无柄块茎，另外，对薯块的总重量以及单个薯块重量进行称量（图2.1C，D），0.25 ｍM的SNP处理下的马铃薯的薯块重量显著高于其他处理，所以选用了SNP浓度为0.25 ｍM进行后续实验。
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第3章 StS P6A的启动子以及马铃薯MYC家族的生物信息学分析 .............................. 45
3.1 引言 .............................. 45
3.2 材料和方法 ............................ 46
第4章 结薯关键基因sp6a突变体的转录组测序及分析 ................... 60
4.1 引言 ............................ 60
4.2 材料与方法 ...................... 60
第5章 差异表达基因StFPF的克隆及功能验证 ........... 80
5.1 引言 .................................... 80
5.2 材料和方法 ........................ 80
第6章 盐和渗透压胁迫可以提高CRISPR/Cas9介导的马铃薯基因组编辑效率
6.2 材料和方法
6.2.1 试验引物
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第7章 结论与展望
7.1 结论
1、用不同浓度的SNP对二倍体马铃薯进行处理，结果显示0.25 mM的SNP能够显著增加二倍体马铃薯的结薯个数，单个薯块重量以及结薯总重量，0.25 mM的SNP诱导下块茎形成过程中10个块茎形成相关基因的表达分析结果表明，蔗糖通过调控结薯相关基因的表达诱导块茎形成；其中，StSP6A是控制马铃薯块茎形成的关键基因，SNP浓度增加会引起StSP6A表达量的显著上调，表明StSP6A在SNP诱导马铃薯块茎形成中起关键作用，0.25 mM的SNP 并不能使sp6a敲除株系提高结薯，证明NO诱导结薯的过程发生在SP6A的上游。
2、对SP6A的启动子序列进行分析，挑选了其中顺式作用元件数目较多的MYC家族进行全基因组鉴定、生物信息学分析以及其在SNP诱导条件下的表达模式分析。结果表明，在马铃薯中共鉴定到MYC家族成员14个，编码402~702aa氨基酸，分布于6条染色体上。根据MYC家族在不同组织中的表达模式进行分析，各个成员在不同组织的表达水平存在较大差异。对SNP诱导结薯过程中表达模式进行分析，其中MYC5和MYC7在6d和10d的表达量显著上调，表明MYC5和MYC7可能参与了NO诱导结薯过程，挑选StMYC7进行过表达，过表达结果表明StMYC7能够提高马铃薯的结薯产量。
参考文献（略）