本文是一篇农业论文，本研究将等离子体技术、超声波微波联用技术和高压脉冲电场技术用于提取工艺升级研究，探索了适合紫杉烷类化合物生产的最佳提取方法及参数，并在悬浮细胞紫杉醇提取中进行了验证。
第1章 绪论
1.1 研究背景和意义
随着现代社会人们生活方式的改变，癌症已成为全人类最普遍的死亡原因 [1]。据国家癌症中心最新数据统计，2016年全国恶性肿瘤新发病例约406.4万例，新发癌症死亡病例241.35万例。巨大的确诊病例背后是人们对抗癌药物需求的不断增加。早在2016年我国出台的《“健康中国2030”规划纲要》中已明确提出优化健康服务，2030年要实现总体癌症5年生存率提高15%，即不低于46.6%[2]。为了解决这一突出问题，许多专家学者进行了相关研究，提出普及癌症筛查、减少吸烟人数、提高治疗水平等方案[3]。红豆杉属植物中含有的紫杉醇因具有广谱高效的抗肿瘤活性，是提高癌症患者生存率的主要药品，市场需求不断增加。
东北红豆杉（Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.）（图1.1），属于裸子植物门红豆杉科红豆杉属，是一种生长缓慢的濒危常绿乔木或灌木，主要生长在中国东北、朝鲜半岛、日本和俄罗斯远东地区[4]，属于我国一级重点保护野生植物[5-7]。《本草纲目》和《东北药植志》等书中已经记载，其枝叶均能入药，能够治疗包括霍乱、伤寒在内的多种疾病，具有利尿和清热通经止痛的功效。如今，东北红豆杉又被发现具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗菌活性，可用来治疗糖尿病和高血压[8]。除黄酮、木脂素、类固醇，酚酸，倍半萜和糖苷等药用活性成分外，东北红豆杉还特有150余种紫杉烷类化合物[8]，具有极高的开发利用价值。
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1.2 紫杉醇的制备方法
紫杉醇的制备方法可大致分为直接提取法、化学全合成法、化学半合成法、发酵法和悬浮细胞培养法[18]。
1.2.1 直接提取法
直接提取法以红豆杉根茎叶为原料，采用各种提取方法获取紫杉醇，其产量取决于种属、树龄、组织、生长环境、提取技术等因素[19, 20]，为目前最常用的紫杉醇获取途径[18]。Zhou等人[21]和崔海超等人[22]均报道，东北红豆杉中紫杉醇含量显著高于曼地亚红豆杉和南方红豆杉，又以树皮中的含量最高[10]。然而，树皮属于不可再生资源，没有树皮的红豆杉存活率几乎为零。为保证紫杉醇供应，一方面，我国积极倡导人工栽培红豆杉，以缓解紫杉醇来源紧张问题[13, 23, 24]；另一方面，科学家正在探索以再生能力较强的红豆杉枝叶为原料进行提取，以降低对红豆杉资源的破坏[25]。
1.2.2 化学全合成法
化学全合成法是解决紫杉醇供应的理想选择。然而，紫杉醇复杂结构大大增加了化学合成难度[26]。自1994年由Holton和Nicolau首次实现后，陆续有学者报道紫杉醇化学全合成路径[13]。2022年Chida等人[27]首次将HMPA作为助溶剂催化紫杉醇全合成，流程如图1.3所示。但该方法存在合成路线复杂（近30步反应），反应条件苛刻，产率低，生产成本高、毒副产物多等缺点，严重限制了工业化应用[17]。
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第2章 等离子体预处理法提取紫杉烷类化合物工艺研究
2.1 材料与设备
2.1.1 试验材料
东北红豆杉枝叶采自吉林大学生物与农业工程学院东北红豆杉资源圃内栽种的十八到二十年生东北红豆杉树，一年生新梢，于七月中旬取半木质化茎段。
2.1.2 试剂与设备
本章所用的试剂、设备见表2.1、表2.2。
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2.2 试验方法
2.2.1 样品前处理
将东北红豆杉枝叶在室温阴凉处风干，然后在研钵中研磨，按照标准筛网大小（40、80、120、160 和200目）将粉末进行筛分，置于阴凉干燥避光处。粉末的平均粒径分别为0.425、0.178、0.125、0.100和0.075 mm。
2.2.2 等离子体预处理
参考Kim等人的方法[132]，准确称取2 g东北红豆杉粉末均匀分布于聚苯乙烯培养皿（70 mm直径）。启动真空泵将气室脱气至85 Pa，持续40 s，点击开始进气系统，待稳定后点燃等离子体并持续一定时间。完成处理后依次关闭进气系统，真空泵，点击放气系统，待内外压强一致后打开真空室，取出样品。
2.2.3 固液浸提法提取紫杉烷类化合物
固液浸提法在天然产物的提取中得到广泛应用，紫杉烷类化合物的提取过程如Ribas等人[131]所述。准确称取2 g东北红豆杉粉末于圆底烧瓶中，加入100 mL二氯甲烷-乙醇（1:1，v/v）溶液。在回流装置中于40℃下提取2 h，5000 rpm离心10 min。取上清液于旋转蒸发仪（40℃）中浓缩至干燥。将残留物复溶于甲醇进行定性和定量分析。在进入色谱仪之前，样品溶液通过0.22 μm尼龙膜过滤，每个试验重复3次。
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第3章 不同方法提取紫杉烷类化合物工艺研究 .................. 37
3.1 材料与设备 ........................ 37
3.2 试验方法 ................................. 38
第4章 诱导子对东北红豆杉悬浮细胞及紫杉醇产量的影响研究 .... 75
4.1 材料与设备 .............................. 76
4.2 试验方法 ................................... 78
第5章 PEG、CD 和 SA 联合诱导东北红豆杉悬浮细胞的转录组测序及高产紫杉醇机制解析 ............................ 107
5.1 材料与设备 .............................. 107
5.2 试验方法 ............................ 108
第5章 PEG、CD和SA联合诱导东北红豆杉悬浮细胞的转录组测序及高产紫杉醇机制解析
5.1 材料与设备
以东北红豆杉悬浮细胞为试验材料。本章部分所需的试剂、设备同4.1、4.2，补充的试剂、仪器与设备见表5.1、5.2。
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第6章 结论与展望
6.1 结论
为提高紫杉烷类化合物（主要紫杉醇）的产量，本研究以东北红豆杉为原料，探索了等离子体预处理技术、超声波微波联用技术和高压脉冲电场技术在紫杉醇生产中的最佳工艺参数，并在悬浮细胞紫杉醇提取中进行验证；为建立悬浮细胞高效诱导紫杉醇技术体系，通过在悬浮细胞对数生长期添加不同功能诱导子，探索了诱导紫杉醇高表达的最佳诱导子优化组合，并利用转录学技术初步探索了相关机制。主要结论如下：
1. 多种技术提取紫杉烷类化合物生产工艺研究
本研究将等离子体技术、超声波微波联用技术和高压脉冲电场技术用于提取工艺升级研究，探索了适合紫杉烷类化合物生产的最佳提取方法及参数，并在悬浮细胞紫杉醇提取中进行了验证。等离子体辅助固液提取法的最佳工艺参数为等离子体功率310 W，处理时间205 s，装载量1.0 g，此条件下紫杉烷类化合物得率为507.81 μg/g，比传统固液萃取法提高了46.68%。机制研究表明等离子体预处理降低了东北红豆杉粉末水分活度和亮度值，增加了红度值，使细胞表面破碎并产生孔洞，增加细胞表面氧元素含量。超声波微波联用法的最佳提取工艺参数为：超声功率300 W，微波功率 215 W，处理时间 120 s，提取温度 50℃，料液比1:60，提取次数2次，筛网目数130目，在此条件下紫杉烷类化合物得率为570.32 μg/g。高压脉冲电场法的最佳提取工艺参数为：电场强度16 kV/cm、脉冲数8、筛网目数160目，此时紫杉烷类化合物得率为672.13 μg/g。
通过对比固液提取法（C）、等离子体辅助固液提取法（CP）、超声波微波联用提取法（UME）、高压脉冲电场提取法（PEF）、等离子体辅助超声波微波联用提取法（CP+UME）、等离子体辅助高压脉冲电场提取法（CP+PEF）处理东北红豆杉枝叶后紫杉烷类化合物得率以及提取后残渣形貌、结构和性质，得出：等离子体辅助高压脉冲电场提取法得到的紫杉烷类化合物得率最高为787.25 μg/g，分别是C、CP、UME、PEF和CP+UME提取紫杉烷类化合物得率的123%、56.41%、37.07%、20.05%和20.80%。效果对比结果表明，经CP+PEF处理后，残渣纤维素、半纤维素和木质素的相对结晶度下降，特征基团吸收峰强度最高，热稳定性低于其他5种提取方法，且细胞结构破坏程度高于其他处理。将CP+PEF技术作用于东北红豆杉悬浮细胞，发现紫杉醇得率比超声波法高。
参考文献（略）