本文是一篇农业论文，本研究了解共生菌与害虫农药耐受性之间的关系，将为深入研究共生菌—共生菌共生体系的功能和协同进化以及杀虫剂抗性的治理提供参考。
1 绪论
1.1 赤拟谷盗研究概况
赤拟谷盗Tribolium castaneum（Herbst）是已知非常重要的次生性储粮害虫，属于鞘翅目（Coleptera）拟步甲科（Tenebrionidae）拟谷盗属（Tribolium），在全世界都广泛存在[1]。在我国，赤拟谷盗遍布各个省市和地区（西藏地区除外）。它的耐干燥能力强，成虫寿命长和繁殖能力强。它的食性复杂，危害广泛，除了危害面粉和谷物以外，还可以危害薯干、豆类、药材、椰子、花生、酒曲、可可、棉子等。赤拟谷盗对粉类粮食危害最为严重，当赤拟谷盗大量发生时，会使被污染过的粮食产生一种难闻的臭味，尤其是当面粉被严重污染后往往会形成腥臭味块状物质，颜色也会改变，使其变得无法食用，造成巨大的经济损失[2]。同时，随着赤拟谷盗的全基因组在2008年被成功注释[3]，目前对赤拟谷盗生理已经有非常成熟的研究方法，而且赤拟谷盗有繁殖周期短、繁殖力强、饲养简单等特点，已经成为一种新型的模式昆虫，在生理学、毒理学等生物研究领域有重要地位[4]。
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1.2 磷化氢研究与应用现状
在粮食储藏过程中最大的威胁源自于害虫的为害，因此害虫防治便成为粮食储藏过程中最关键的问题，目前，化学熏蒸法仍是我国乃至世界储粮害虫防治的重要技术，目前全球广泛使用的储粮熏蒸剂主要是磷化氢[5]。磷化氢有很多优点，其中包括杀虫广谱、具有杀卵作用、药效高、有效浓度低、用药量少、对粮食基本无残留、对粮食品质无影响、施药安全、扩散性强，施药操作简单、生产成本低，处理费用低等，因此，自20世纪60年代我国开始应用以来，便一直是主要储粮害虫熏蒸剂[6]。但是，磷化氢长期既单一又不合理地应用导致重要的储藏物害虫都产生了严重的磷化氢抗性，如赤拟谷盗、米象Sitophilus oryzae、玉米象Sitophilus zeamais、谷斑皮蠹Trogoderma granarium、烟草甲Lasioderma serricorne、谷蠹Rhyzopertha dominica、印度谷螟Plodia interpunctella等都已经产生了很强的磷化氢抗性[7]。
磷化氢是最常用的储粮害虫熏蒸剂，其作用机制主要有三种：干扰氧化还原系统、抑制能量代谢和干扰神经传导[8]。值得注意的是，上述机制并非相互排斥，而是相互联系的。实验观察结果也证实，高浓度的磷化氢是一种速效的杀虫剂，而低浓度的磷化氢则是一种作用缓慢的杀虫剂[9]。在处理害虫时，对大多数杀虫剂而言，其浓度与害虫致死时间之间呈线性关系，而这两类作用机制致使磷化氢浓度与害虫致死时间之间的关系呈非线性的反比关系[10]。
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2 赤拟谷盗肠道共生菌的分离与鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 实验试虫的饲养
赤拟谷盗实验试虫的品系为GDFS（广东佛山）、DAF（澳大利亚）、GAI（美国）、HBWH（湖北武汉）、MU（美国）和GDST（广东汕头），经储粮生态昆虫研究实验室纯化培养多代。在透明玻璃瓶中饲养，培养条件：温度（30±1）℃、相对湿度（65±5）%，于恒温恒湿培养箱中。将小麦洗净烘干至水分为13%~14%后利用磨粉机打碎制成全麦粉，过40目筛后和酵母粉以19: 1的比例混合后作为饲料，置于-20 ℃保存。
2.1.2 试剂与设备
试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（Accurate Biotechnology Co. Ltd）。使用的培养基为LB（肉汤）培养基、EE（肠道菌增菌）培养基、EC（肠球菌增菌）培养基和CN（假单胞菌基础）培养基，按照如下的配方进行配置。
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2.2 实验方法
2.2.1 不同地理品系赤拟谷盗磷化氢耐受性鉴定
使用FAO发表的检测储粮害虫磷化氢耐受性的标准方法，并根据两种耐受性水平的特征，对FAO的方法进行了改进，并建立了两种鉴别剂量（浓度和处理时间）来诊断赤拟谷盗的弱和强磷化氢耐受性水平[54]。磷化氢通过磷化铝片剂和10%的稀硫酸由排水法在通风橱内制成。从培养的六个地理品系的赤拟谷盗中挑选出发育健康且羽化7 d内的成虫。将挑选出来的赤拟谷盗放在侧壁上涂有聚四氟乙烯的小瓶子中，每个小瓶子放置50头，然后将每六个小瓶子和一个装有饱和食盐水的小瓶子放置在干净的熏蒸罐中，首先将熏蒸罐放在30±1 ℃下稳定12 h。然后用气密注射器抽取一定体积的磷化氢气体。采用鉴别剂量进行检测，设置0.045 mg/L和0.273 mg/L[55]。在30 ℃的避光条件下熏蒸20 h后打开熏蒸罐进行散气，将熏蒸过后的赤拟谷盗从小瓶子中取出放置在小号培养皿中，加入适量饲料并将其正常的培养环境中，14 d后观察记录每个培养皿中赤拟谷盗的死亡头数，计算其死亡率。每个处理5个生物学重复。
同时采用Abbott公式对死亡率进行校正：
校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%
2.2.2 赤拟谷盗肠道共生菌的分离培养
根据2.2.1的所筛选的品系，挑选新羽化7 d之内的赤拟谷盗50头，饥饿处理24 h后，用酒精浸洗两次，再用无菌水冲洗两次，避免外界微生物的污染。在无菌操作台上进行肠道解剖，将清洗过后的赤拟谷盗放入无菌水中，在水中解剖出完整的肠道，随即将其移入1.5 mL离心管中，放入全自动破碎仪中60 HZ研磨60 s，接下来使用无菌研磨杵来研磨匀浆，得到均匀的肠道菌液。将肠道菌液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，使用涂布平板法将稀释过的肠道菌液均匀涂布在LB培养基、EE培养基、EC培养基和CN培养基上，每组3个重复。之后将其放置在无菌培养箱中37 ℃培养48~72 h。每过12 h观察一次培养基，同时记录菌落的生长状况。
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3 肠道共生菌去除与回接方法的优化 ...................... 23
3.1 实验材料 .............................. 23
3.1.1 实验试虫的饲养 ............................. 23
3.1.2 试剂与设备 ...................... 24
4 肠道共生菌对赤拟谷盗磷化氢耐受性和适合度的影响 .................. 41
4.1 实验材料 ............................... 41
4.1.1 实验试虫的饲养 .............................. 41
4.1.2 试剂与设备 .............................. 41
5 肠道共生菌对磷化氢处理赤拟谷盗氧化还原系统的影响 .............. 49
5.1 实验材料 ....................... 49
5.1.1 实验试虫的饲养 .............................. 49
5.1.2 实验试剂与设备 .............................. 50
6 肠道共生菌对赤拟谷盗免疫应答的影响
6.1 实验材料
6.1.1 实验试虫的饲养
本章研究的赤拟谷盗是磷化氢耐受性强的GDST地理种群，培育条件同2.1.1。
6.1.2 实验试剂与设备
共生菌是可以调控宿主基因的表达的，据此推测共生菌可能通过调控宿主解毒、杀虫剂靶标和免疫系统相关基因的表达来影响宿主抗药性的形成过程[31]。一种肠球菌可以通过刺激免疫系统相关基因，抗菌肽表达量下调，溶菌酶表达量上调以此来提高小菜蛾的抗药性[40]。前期的研究我们也证明了抗氧化酶与磷化氢的耐受性直接相关，而且也证明了屎肠球菌和粪肠球菌可以直接影响抗氧化酶的表达和活力，这就破坏了赤拟谷盗体内原本的氧化平衡，从而影响了赤拟谷盗的磷化氢耐受性。有研究发现，昆虫肠道内的常驻共生菌可能会引起一定的免疫反应，ROS是调节肠道微生物稳态的昆虫先天免疫途径的重要组成部分，这主要是由双氧化酶（Dual oxidase，DUOX）催化生成的[103]。DUOX的表达主要DUOX活性途径（PLCβ-IP3-Ca2+-Duox-ROS）和DUOX表达途径（IMD-MEKK1-MKK3-p38-ATF2-DUOX）来控制，这两条通路激活会产生大量的ROS[104]。此外，Toll信号通路是免疫应答途径的重要组成部分，它的激活会产生大量的抗菌肽[105]。这可能会对昆虫体内的氧化平衡和昆虫的生理状态产生影响[89, 106]，肠道共生菌的回接是否会影响赤拟谷盗体内的免疫平衡还不清楚。
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结论与展望
结论：
本研究首先通过测定不同地理品系赤拟谷盗的磷化氢耐受性，筛选出了磷化氢耐受性强的赤拟谷盗广东汕头品系（GDST）。然后，以此为GDST品系为研究对象，分离和鉴定肠道共生菌，优化肠道共生菌的去除和回接条件，研究特定肠道共生菌对赤拟谷盗磷化氢耐受性、适合度、氧化还原系统和免疫系统的影响。主要的结论如下：
（1）通过传统的微生物培养和细菌16S rDNA分子鉴定技术，对赤拟谷盗的肠道共生菌进行体外培养和筛选，成功培养出12株肠道共生菌，分别为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai、血红短杆菌Brevibacterium sanguinis、粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、地下芽孢杆菌Mesobacillus subterraneus、树状微杆菌Microbacterium arborescens、莱拉微球菌Micrococcus lylae、毛蚶鸟氨酸芽孢杆菌Ornithinibacillus scapharcae、头状葡萄球菌Staphylococcus capitis、溶血性葡萄球菌Staphylococcus hominis、克氏葡萄球菌Staphylococcus kloosii和表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis。
（2）抗生素处理优化实验表明，药敏试验表明赤拟谷盗的肠道共生菌对不同的抗生素敏感性不同，生理指标和发育参数测定结果表明不同的处理浓度与时间对赤拟谷盗成虫与幼虫均会产生显著影响，并基于此确定了赤拟谷盗成虫最佳的处理方式为20 μg/g处理72 h，幼虫最佳处理方式为10 μg/g处理72 h，同时肠道共生菌定量结果验证了在上述两种处理方式下，可以在达到去除效果的前提下，将抗生素的负面影响降到最低。
（3）通过对赤拟谷盗的磷化氢耐受性以及适合度测定，研究了肠道共生菌与赤拟谷盗磷化氢耐受性的联系。在磷化氢的胁迫下，屎肠球菌回接组和粪肠球菌回接组的赤拟谷盗与无菌组相比，死亡率明显升高，耐受性明显降低，成虫的产卵量明显下降。这表明屎肠球菌与粪肠球菌可以降低赤拟谷盗磷化氢的耐受性。
参考文献（略）