本文是一篇农业论文，本试验通过荧光定量 PCR 对 5 个差异表达基因的表达情况进行了验证。结果表明基因表达量的变化趋势一致，结果可靠。此外，一些和氨基酸、植物激素、过氧化物酶相关的基因在两个黑穗醋栗果实品种中表达差异较大，有可能也会影响黑穗醋栗果实品质。
1 前言
1.1 黑穗醋栗果实内在品质研究进展
1.1.1 黑穗醋栗中的抗坏血酸
AsA 含量随着黑穗醋栗品种变化而变化[17]，许多因素都会影响植物体内 AsA 的含量，如品种、气候和生长条件、栽培措施、收获时的成熟程度和储存条件[18]。例如生长在芬兰高纬度地区的黑穗醋栗 AsA 含量较高，较低纬度的黑穗醋栗果实中 AsA 含量较低[18]；不同光照强度下生长的黑穗醋栗果实 AsA 含量不同，遮阴降低果实中的 AsA 含量[19]。品种对黑穗醋栗 AsA 的影响最大，超过了环境产生的影响[20] 。自然生长条件下，黑穗醋栗 AsA 的积累始于浆果生长的早期阶段（直径 4 mm 到 12 mm），果实成熟时达到稳定期[21]。黑醋栗通过L-半乳糖途径合成 AsA[22]，这与苹果（Malus domestica）、猕猴桃（Actinidia）、番茄（Solanum lycopersicum）和柑橘类水果[23]一致。黑穗醋栗 AsA 代谢途径中，抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）和 L-半乳糖-1, 4-内酯脱氢酶（GalLDH）共同参与调节黑穗醋栗果实中的总 AsA 含量[21]。除了 AsA 合成途径，黑穗醋栗叶片和果实之间可能存在另一种运输，即 AsA 长距离运输[24]。也有证明黑穗醋栗中AsA 和蔗糖、己糖的含量正相关关系[25]，表明浆果中的游离糖可作为 AsA 的前体发挥重要作用，增强了黑穗醋栗植物体内长距离运输的可能性。
1.1.2 黑穗醋栗中的类黄酮
多酚具有强大的抗氧化剂和清除自由基的活性，黑穗醋栗因其高浓度多酚而被广泛认可[26]。多酚不仅可调节果实涩味口感[27]，还是果实香气挥发物的前体[28]，其中花色苷还可丰富果实颜色[29]。果实中多酚的含量主要受遗传差异的影响，栽培技术、收获时间、生长地点等环境因素也会影响多酚含量[30]。类黄酮种类繁多，包括花青素、黄酮醇、黄酮、儿茶素和黄烷酮[31]。类黄酮在植物抗微生物胁迫[32]以及促进人类健康方面[33]发挥着重要作用。类黄酮所有成分中，杨梅素在黑穗醋栗中含量最高，其次是槲皮素[34]。与葡萄果实相同，黑穗醋栗中类黄酮和花色素苷的总含量之间存在明显的相关性[35]，可能类黄酮的生物合成与花青素有关[36]。
农业论文怎么写
............................
1.2 转录组在果树中的应用
1.2.1 转录组发展历史及 RNA-seq 技术概述
遗传信息常通过中心法则的方式进行传递。转录组是给定细胞类型中 RNA 转录本的完整组装[71]。1997 年转录组分析首次应用于研究[72]。在过去的十年中，已经开发了许多高通量下一代 DNA 测序（NGS）平台。现在已经过时的 Roche 454 GS-FLX 是第一个实现读取序列长度>500 bp 的 NGS 测序平台，但每个数据点的测序成本相对高于其他 NGS 平台[73, 74]。Illumina 后来收购的 Solexa 测序平台产生了 100～150 bp 的短序列读数，现在能够在一次运行中以更低的成本生成超过 200G bp 的序列数据。此外，双链 DNA 的短片段可用于构建配对末端测序文库[75]。PacBio 是第三代测序平台，与 Roche 454 相比，其序列阅读长度增加了10 倍以上，比 Illumina 短阅读测序平台增加了 100 倍。PacBio 转录组分析基于单分子实时（SMRT）同工型测序（Iso-seq）化学方法，并使用 Clontech SMARTer PCR 试剂盒生成文库。现在 PacBio 已从 RSII 改进为 Sequel II，每个 SMRT 单元可提供 20G bp 以上的序列数据。 PacBio IsoSeq 化学试剂是鉴定 RNA 转录本中剪接变体的理想选择[76]。牛津纳米孔技术（ONT）是另一种单分子测序 RNA-seq 平台，与其他 NGS 平台相比刚开始的错误率比较高，但贵在便利且效益高[77]。2014 年发布了第一个原型 MinION ONT 系统[78]，之后发布了改进版本，即 GridION 或 PromethI ON，以实现更高的计算量[79]。
高通量测序技术的迅速发展大大提高了发现基因的效率[76, 80]。测序技术的发展为科学家研究植物转录组提供了强有力的工具。Illumina 测序技术灵敏度、准确度都很高；成本低于第三代测序；但是它的阅读长度很短，测序后需要复杂的剪接过程[81]。转录组学改变了传统的研究模式，加速了基因组学的研究。RNA 测序技术（RNA-Seq）是新用于转录组分析的高通量 cDNA 文库测序技术，可产生数百万个短 cDNA 序列。然而，RNA-seq 通过数百万个短cDNA 片段产生的数据与参考基因组比对的方式进行分析，因此不适用于基因组部分或完全未测序的生物样品。从头转录组组装提供了一种克服这种限制的方法。这种方法在没有参考基因组的帮助下将 RNA-Seq 阅读组装成转录本，理论上允许研究人员重建完整转录组的序列，识别所有表达的基因，捕获转录本的表达水平[82]。这项技术迅速加深了我们对选择性剪接和基因组功能元件的理解[83]。RNA-Seq 不依赖于探针杂交的使用，可用于研究不同发育阶段以及良性和恶性疾病过程中的基因表达[84]。
................................
2 材料与方法
2.1 试验材料
试验所用黑穗醋栗果实材料分别是生长状况良好的 10 年生黑穗醋栗果树‘亚德’和‘黑丰’。‘黑丰’和‘亚德列娜亚’（以下简称‘亚德’）果实品质相差很大。‘黑丰’果小，平均单果重0.8 g；果实含可溶性固形物 14%～14.5%；可溶性糖含量占比 6.97%[105] ；有机酸含量 3.43 g[105] ；花色苷含量 38.55 mg/g；AsA 含量平均为 144.79 mg/100g•FW[106]；口感甜酸。‘亚德’是综合经济性状优良品种，果实极大，平均单果重比‘黑丰’重 2.8 g，最大单果重比‘黑丰’重3.4 g[107]；可溶性糖含量比‘黑丰’高 0.30%；有机酸含量比‘黑丰’低 0.93 g；花色苷含量比‘黑丰’少 5.14 mg/g[105]；总糖含量 13.6%；总酸含量 2.25%；AsA 含量平均比‘黑丰’高 129.36 mg/100g•FW[106]。 ‘亚德’和‘黑丰’以 0.5 m×1.0 m 的株行距种植在黑龙江哈尔滨东北农业大学黑穗醋栗种植资源圃中。果树资源圃位于 44°04′ N，125°42′ E，海拔 155～175 m，其黑钙土PH 在 5.5～7.0 之间，土层深厚。本地年平均气温 15℃，每年日照时间约为 2,458 h，年降水量约为 554.6 mm，每年均有 125 天无霜期。试验期间施肥管理技术与常规田间生产管理相同。
根据果实生长发育过程不同特点，将黑穗醋栗生长分为四个阶段，分别是幼果期、膨大期、转色期和成熟期。在 2019 年 5 月～7 月和 2020 年 5 月～7 月时间段内进行采样，均匀采集 30 个果树不同位置的果实且每三棵果树作为一次重复。果实从树上采下后迅速放入液氮中冷冻并置于﹣80℃直至提取 RNA。RNA-seq 分析中不包括起始日（第 0 天）
.........................
2.2 果实品质测定
2.2.1 果实单果重及横纵径测定
单果鲜重：从田间采集 30 个正常生长的黑穗醋栗果实，使用电子天平称取总重量后取均值。
果实横纵经：从田间采集 30 个健康新鲜的黑穗醋栗果实，使用游标卡尺测量果实横纵径并取均值。
根据每次观测记录的平均值，绘制果实生长曲线。
2.2.2 可溶性固形物测定
参考 GB/T 12295-1990《水果、蔬菜制品可溶性固形物含量的测定》采用折光仪测定，取3 次测定均值。
2.2.3 可滴定酸测定
参考 GB/T 12295-1990《水果、蔬菜制品可滴定酸度的测定》采用酸碱滴定法测定，3 次测量取均值。
2.2.4 总酚含量测定
参考 John[108]并稍加修改测定总酚，测量 3 次取均值。
2.2.5 总黄酮含量测定
参照 Zou[109]的方法测定总黄酮含量，测量 3 次取均值。
2.2.6 抗坏血酸含量测定
参考 GB 5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》用碘酸钾滴定法测定，3 次测量取均值。
3 结果与分析 ....................................... 10
3.1 黑穗醋栗果实发育过程中品质变化 .................................. 10
3.2 黑穗醋栗果实 RNA 质检结果............................... 12
4 讨论 ....................... 57
4.1 ‘亚德’和‘黑丰’果实不同时期的基因分析 ............................... 57
4.1.1 ‘亚德’和‘黑丰’不同时期果实DEG 数量 ........................................ 57
4.1.2 ‘亚德’和‘黑丰’不同时期果实DEG 注释 ........................................ 57
5 结论 ........................... 62
4 讨论
4.1 ‘亚德’和‘黑丰’果实不同时期的基因分析
4.1.1 ‘亚德’和‘黑丰’不同时期果实 DEG 数量
比较同一时期的‘亚德’和‘黑丰’果实，两品种基因表达量的上下调变化不尽相同。‘黑丰’幼果期有 241 个基因特异性的上调，和 242 个基因特异性的下调；膨大期有 1,020 个基因特异性的上调，889 个基因特异性的下调；转色期有 752 个基因特异性的上调，和 796 个基因特异性的下调；成熟期有 1,602 个基因特异性的上调，1,220 个基因特异性的下调。幼果期和转色期差异表达基因上调数和下调数相近，膨大期和成熟期中差异表达基因上调数目大于下调数目。说明‘黑丰’和‘亚德’果实品质的不同主要集中在膨大期和成熟期，在日后关于黑穗醋栗品种差异的研究中可重点膨大期和成熟期。成熟期的 DEG 涵盖了植物体内多种生物过程，如代谢途径、应对环境胁迫途径。因此‘黑丰’和‘亚德’黑穗醋栗果实的不同可能是代谢途径、响应生物胁迫过程等生物过程的迥异造成的。
4.1.2 ‘亚德’和‘黑丰’不同时期果实 DEG 注释
黑穗醋栗转录组数据鉴定了 70,224 条 unigene，占总数的 60.1%。在 NR 数据库获得的注释中，有 10.31%黑穗醋栗 unigene 与葡萄的序列同源性较高，表明黑穗醋栗与葡萄亲缘关系最近。葡萄与黑穗醋栗特征状态有所类似，但是生长环境迥异，二者的基因序列同源性相对较高，未来关于黑穗醋栗的相关研究可借助葡萄的信息资源。‘亚德’和‘黑丰’四个时期的 DEG在 GO 富集统计结果大致相似，均在“细胞成分”、“细胞”和“膜部分”等细胞组分能条目；“细胞过程”和“代谢过程”等生物过程功能条目以及“催化”、“结合”等分子功能条目。由此可以推测‘亚德’和‘黑丰’的主要差异主要涉及代谢。
差异表达基因中有 699 个基因参与 13 个代谢通路。KEGG 富集分析表明幼果期的‘黑丰’和‘亚德’DEG 富集代谢途径仅有“单萜类生物合成”，且‘黑丰’比‘亚德’的基因表达量高，说明幼果期‘黑丰’积累的萜类物质更多。黑穗醋栗的香气中包含萜类物质[103]，推测‘黑丰’有可能比‘亚德’具有更强烈的果香。
农业论文参考
............................
5 结论
本试验对 24 个‘亚德’和‘黑丰’黑穗醋栗果实进行转录组测序，分析不同黑穗醋栗品种在同一时期以及同一品种不同时期的 DEG。主要结论如下：
（1）‘亚德’和‘黑丰’两个品种的黑穗醋栗果实在生长发育过程中单果重、横纵径变化和果实品质有很大的差异。黑穗醋栗果实生长发育过程中 AsA，总酚和总黄酮的变化趋势有所相似，均是幼果期为最大值。可溶性固形物在转色期到成熟期增长最快。可滴定酸在幼果期到膨大期增长最快。
（2）转录组数据分析得到不同品种黑穗醋栗果实不同时期 KEGG 富集通路不同。果实幼果期差异基因富集通路仅有“单萜类生物合成”；膨大期显著富集的通路有：“植物激素信号转导”、“DNA 复制”和“植物-病原相互作用”；转色期显著富集的通路有“植物-病原体相互作用”；成熟期显著富集的通路有：“乙醛酸和二羧酸代谢”、“碳代谢”、“柠檬酸循环”、“丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢”和“丙酮酸代谢”。每组的 GO 差异基因富集结果大致相似，主要富集在“细胞成分”、“细胞”和“膜部分”等细胞组分功能条目上；“细胞过程”和“代谢过程”等生物过程功能条目上；“催化”、“结合”等分子功能条目上。进一步预测获得 90,789 个 CDS 序列。
（3） KEGG 分析差异基因中果实品质相关的通路有 “单萜类生物合成”、“类黄酮生物合成”和“抗坏血酸生物合成及循环”，共 36 个差异基因。通过荧光定量 PCR 对 5 个差异表达基因的表达情况进行了验证。结果表明基因表达量的变化趋势一致，结果可靠。此外，一些和氨基酸、植物激素、过氧化物酶相关的基因在两个黑穗醋栗果实品种中表达差异较大，有可能也会影响黑穗醋栗果实品质。
参考文献（略）