本文是一篇农业论文，笔者经过研究，得出以下结论：菊芋叶片浸提液含有的化合物种类及含量最多且与南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率之间存在正相关的化合物种类及含量最多，使其对南方根结线虫的抑制效果最好；1%菊芋叶片浸提液可以显著抑制番茄根结线虫病害且不影响连作番茄的生长，并且可以明显提高连作番茄的抗性以及改变了土壤微生物群落。
1 前言
1.1 研究目的与意义
番茄（Solanum lycopersicum）是世界范围内主要的设施蔬菜栽培作物，由于市场方面对其需求的不断扩大，设施种植面积逐年增加，连作现象愈发严重[1]，导致土壤环境愈发恶化，有害病原微生物的增加和毒素的积累使番茄的生长受到严重抑制。根结线虫病害是设施番茄栽培中最难防治且危害最为严重的病害之一，随番茄种植茬次的增加而逐渐加重，会导致番茄产量下降，发病严重时甚至会致使番茄绝产[2, 3]。目前应用的根结线虫病害防治方法有很多，包括：抗性育种、物理防治、化学防治、农业防治以及生物防治等，生物防治技术因其更加环保、安全、无毒，减轻植物耐药性的优势，具有广阔的发展前景[4]。
利用生物多样性及化感作用原理防治根结线虫病害是目前主要的发展趋势及研究热点。有大量研究表明以万寿菊为代表的菊科作物对根结线虫病害具有较好的抑制效果[5-10]，其中同属于菊科植物的菊芋也可有效防治根结线虫病害。菊芋（Helianthus tuberosus L.）作为一种原产于北美的多年生菊科植物[11]，具有生长速度快、地上部生物量巨大、耐盐碱等逆境及抗植物病虫害的优点。已有研究表明添加菊芋秸秆对根结线虫病害具有明显的抑制效果，可以改变根际土壤微生物群落[12]，在一定的添加比例范围内还可以促进连作番茄生长[13, 14]。植物秸秆或浸提液的施用可以减轻根结线虫病害的发生并提高番茄抗性。但对菊芋利用的研究中关于菊芋植株浸提液对根结线虫病害及土壤微生物的影响没有相关报道，其抑制根结线虫病害效果及机理还有待进一步研究。
本研究在本课题组前期研究的基础上，选择对番茄根结线虫病害有明显减轻效果的菊芋种质资源-‘J13’为试验材料。通过对菊芋植株不同部位浸提液的比较试验，同时采用 GC-MS 技术分析菊芋植株不同部位浸提液成分及含量的差异，筛选出可以有效防治其根结线虫病害且不影响连作番茄生长的添加部位及浓度；分析添加菊芋植株浸提液后连作番茄抗性及土壤微生物群落是否发生变化以及这种变化与连作番茄根结线虫病害的减轻是否有关。
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1.2 国内外研究动态
1.2.1 根结线虫病害的危害及防治现状
1.2.1.1 根结线虫病害的危害
根结线虫（Meloidogyne）是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，在全球范围内可为害 5000 多种植物[15, 16]，可以导致作物产量大幅度下降，其中茄果类、瓜类、花生、烟草、莴苣、山药等植物受其为害较严重[17, 18]。根结线虫有 80 多个种，南方根结线虫(M. incognita)是其中分布最广、对植物危害最为严重的 4 个常见种之一[19]，在黑龙江、吉林
根结线虫在分类学上是归属于线性动物门下异皮总科的根结线虫属[21]的寄生性线虫。根结线虫需要历经卵、幼虫、成虫才能完成整个生活阶段。根结线虫在二龄幼虫时期开始对寄主植物的根系进行侵染，在植株根部形成瘤状根结，导致植株对其他病虫害的防御能力也降低，在多种病原菌联合侵染的情况下，最终造成巨大的经济损失[22]。
根结线虫的致病机理主要是其二龄幼虫对植株的侧根进行侵染，利用其头部化感器定位到植株根系后，通过口针侵入到植物根尖分生组织，在细胞内迁移找到维管组织并寄生于此[23]，形成巨细胞进而形成大量瘤状物。根结线虫入侵到植物根部后，致使寄主植物的主根和侧根发育不良，进而形成绿豆或小米大小串珠状瘤状物--根结。根结上常产生稀疏细小的新根，新根又被侵染呈现出肿大型根结。由于植株根部发生病变，对养分的吸收、利用均受到了影响，致使寄主植株产量降低[24]，严重时会产生不结实、地上部萎蔫等症状[25]。根结线虫病害在根结线虫侵染初期植株地上部没有明显的发病症状，中期与植株缺素症十分相似，只有在发病严重的后期才会表现出其独特的症状[26, 27]。番茄植株根结线虫病害发病严重且不易控制在很大程度上是因为根结线虫在侵入植株根系时在根系表面留有创口，土壤中其他的病原微生物会通过这些外部创口入侵番茄植株根系，由多种病原造成联合性的混合型病害，使其防控较为不易[28]。
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2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试材料
供试番茄品种：‘东农 722’，由东北农业大学园艺园林学院番茄课题组提供。
供试土壤：东北农业大学园艺设施工程中心连作 8 年的番茄根结线虫病土。采用鲍士旦[102]的测定方法对土壤基本化学性状进行测定：铵态氮 17.58 mg·kg-1；硝态氮 58.60 mg·kg-1；有机质 55.06 g·kg-1；EC 值 0.65 mS·cm-1(1:5，w/v)；pH 7.06(1:5，w/v)。
供试线虫品种：南方根结线虫（Meloidogyne incognita）由东北农业大学设施与生理生态实验室提供，在‘东农 722’番茄品种上扩繁，保存在东北农业大学园艺实验站线虫培养池中。 供试菊芋品种：‘TYD’（J13），由东北农业大学设施与生理生态实验室提供。供试菊芋品种基本信息见下表 2-1。
试验地点：东北农业大学园艺设施工程中心及农业部重点实验室。
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2.2 试验设计
2.2.1 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫的影响
本试验于 2019 年 5 月于园艺园林学院设施生理生态实验室进行。将 10%浓度的菊芋植株各部位浸提液用蒸馏水稀释成 1%（v/v）浓度的溶液。根据菊芋植株不同部位设置为 1%浓度的茎秆浸提液（J）、叶片浸提液（Y）、块茎浸提液（KJ）、蒸馏水对照（CK），共 4 个处理，每个处理三次重复。在 24 孔培养板每孔中加入各部位浸提液 1.5 mL，每孔加入 500 μL 约 300粒卵的虫卵悬浮液，在 28℃条件下培养，分别在 2 d、4 d、6 d、8 d 观察虫卵孵化情况，并计录虫卵孵化情况。
线虫抑杀试验同样在 24 孔培养板中进行，每孔中加入各部位浸提液 1 mL，每孔加入 100 μL 约 100 条二龄幼虫（J2s），以蒸馏水为对照（CK），在 28℃条件下培养，分别在 24 h、48 h、72 h 观察线虫抑杀情况。筛选出杀线效果最好的部位进行下一步试验。
2.2.2 菊芋植株不同部位浸提液的成分分析
试验于 2019 年 7 月在东北农业大学重点实验室中进行，采用气质联用仪测定菊芋植株不同部位浸提液的主要成分。
检测方法为：色谱柱为 Agilent 19091S-433HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，以 GC ALS的进样方式进入 GC 样品进样口，设置进样口温度为 250℃，压力为 7.6522 psi，隔垫吹扫流量为 3 mL·min-1，总流速为 19 mL·min-1，不进行分流，进样针规格为 10 μL，每次进样 1 μL，进样排放速度为 6000 μL/min，L1 气隙为 0.2 μL。升温程序设定为：在 50℃条件下保持 3 min后，以 15℃·min-1 上升到 250℃后，汽化室温度为 340℃，进样量为 1.0 mL，载气 He，载气流量为 1 mL·min-1，不分流，保持 13 min，运行时间为 29.333 min。质谱条件为：EI 离子源，离子源温度为 230℃，电子能量为 69.92 Ev，发射电流为 34.61 Μa，电子倍增器电压 34.61 μA，扫描范围是 50-550 amu。质谱扫描后，利用 NIST 11.0 谱库检索质谱图和 CAS 编码查询比对，并结合有关文献进行鉴定。选取相似度 80 以上的化合物，用面积归一法对各部位色谱峰占总峰面积的百分比进行计算。
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3 结果与分析 ........................... 14
3.1 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫的影响 ................................... 14
3.1.1 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫虫卵孵化的影响 ...................... 14
3.1.2 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫二龄幼虫抑杀的影响 ........................... 14
4 讨论................................ 56
4.1 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫的影响 ................................. 56
4.2 菊芋植株不同部位浸提液的成分分析 ................................. 56
4.3 菊芋叶片浸提液对连作番茄生长及番茄根结线虫病害的影响 ........................... 57
5 结论............................ 62
4 讨论
4.1 菊芋植株不同部位浸提液对南方根结线虫的影响
植物源防治线虫已有几十年的历史，因化学药剂防治根结线虫对环境及人类健康存在严重的危害，使得利用植物来防控根结线虫病害有极大的发展潜力[60, 112, 113]。研究表明，万寿菊植株不同部位浸提液对根结线虫的抑制效果存在差异[114]。苍耳的茎叶提取物对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌能力明显高于根部提取物[49]。苦楝不同部位的水提取液对南方根结线虫二龄幼虫的抑杀效果有很大的区别，当各处理浓度均为 10%时，苦楝叶片的水提取液处理的致死能力较好[115]。另有研究结果表明，菊科作物菊芋对南方根结线虫的抑杀效果与其部位有关，且菊芋叶片提取物可以显著降低棉铃虫幼虫成蛹率和提高死亡率[116]。本试验研究发现，菊芋种质资源-‘J13’植株不同部位浸提液对南方根结线虫均有显著的抑制效果，但不同部位间存在差异；菊芋植株不同部位浸提液均可以显著降低南方根结线虫的虫卵孵化率和提高二龄幼虫的致死率，其中菊芋叶片浸提液的抑制效果最好，其次是块茎浸提液，茎秆浸提液对南方根结线虫也有显著的抑制效果，但较菊芋叶片浸提液和块茎浸提液而言抑制效果较差。菊芋茎秆浸提液对南方根结线虫的抑制效果不好可能是由于菊芋植株茎部木质化程度较高，有效活性成分较少。
外源添加可以显著减轻植物根结线虫病害的发生，这可能是因为外源添加的物质中含有可以使线虫致死的化合物。有研究表明，同一培养条件下不同小种淡紫拟青霉代谢产物的组分、所含物质种类及含量不同，可能是其对南方根结线虫产生不同抑制效果的原因[42]。野地瓜不同部位的抗氧化能力与各部位所含的抗氧化物质的种类及含量有关[117]。本试验研究发现，菊芋植株不同部位浸提液中所含的化合物种类及含量不同，菊芋叶片浸提液中检测出的化合物种类及含量最多，菊芋植株不同部位浸提液中均检测出了酸类、芳香烃、烷烃、酚类、酯类、醛类、酰胺类、酮类、醌类和硅氧烷类化合物。将菊芋植株不同部位浸提液的组分与南方根结线虫二龄幼虫校正死亡率进行相关性分析发现，菊芋植株不同部位浸提液中与南方根结线虫校正死亡率呈显著相关的化合物种类及浓度不同。其中菊芋叶片浸提液中含有的呈显著正相关的化合物种类最多（共 20 种），浓度最高（化合物峰面积为 7.51×108，占菊芋叶片浸提液检测出化合物的 40.76%），其中 15 种化合物呈极显著正相关，浓度为 4.46×107，高于茎秆浸提液和块茎浸提液；且菊芋茎秆浸提液中含有的与南方根结线虫校正死亡率呈显著负相关的化合物种类最多（含有 9 种）且浓度最高（峰面积为 2.69×108，占菊芋茎秆浸提液检测出化合物的 18.62%），高于菊芋叶片浸提液和块茎浸提液。
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5 结论
（1）菊芋植株不同部位浸提液均可以显著抑制南方根结线虫的虫卵孵化和二龄幼虫存活，其抑制效果表现为叶片>块茎>茎秆浸提液，且各部位浸提液间差异显著。
（2）菊芋植株不同部位浸提液中可检测出 60 种化合物，各部位浸提液的组分及含量存在差异，菊芋叶片浸提液中检测出的化合物种类最多（40 种）、含量最高（峰面积为 1.84×109）；菊芋植株不同部位浸提液中与南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率之间存在相关关系的化合物种类及浓度不同，其中菊芋叶片浸提液中含有的呈正相关的化合物种类（20 种）及含量最多（含量为 7.51×108）。
（3）从 5 种添加浓度的菊芋叶片浸提液中初步筛选出 0.5%和 1%的添加浓度对连作番茄的后续生长进行复筛，发现 1%浓度的菊芋叶片浸提液能够明显减轻根结线虫病害且不影响番茄生长。
（4）菊芋叶片浸提液处理显著增加了接种根结线虫后连作番茄根系防御酶 SOD、PPO、POD 和 PAL 活性，显著增加了总酚和木质素含量，并降低了连作番茄根系 MDA 含量。
（5）菊芋叶片浸提液处理提高了连作番茄根际土壤真菌的丰富度，添加后期显著增加了真菌的多样性；添加菊芋叶片浸提液明显改变了土壤微生物的群落结构。将土壤微生物与土壤虫口密度进行相关性分析发现，细菌的 OTU2631（Bacillus）、OTU2277（Bacillus）和真菌OTU994（Mortierella）与土壤虫口密度呈极显著正相关，且添加菊芋叶片浸提液降低了细菌OTU2631（Bacillus）、OTU2277（Bacillus）和真菌 OTU994（Mortierella）的相对丰度。
综上所述，菊芋叶片浸提液含有的化合物种类及含量最多且与南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率之间存在正相关的化合物种类及含量最多，使其对南方根结线虫的抑制效果最好；1%菊芋叶片浸提液可以显著抑制番茄根结线虫病害且不影响连作番茄的生长，并且可以明显提高连作番茄的抗性以及改变了土壤微生物群落。
参考文献（略）