本文是一篇农业论文，本研究从羊肚菌内生细菌中分离到的菌株B. subtilis A9在平板对峙实验中对丝枝蜡蚧霉菌L.aphanocladii G1有较强的拮抗作用。室内盆栽试验中对菌株B. subtilis A9进行了安全性评价，单独喷施菌株B. subtilis A9对羊肚菌无明显差异，证明菌株B. subtilis A9作为生防菌的安全性，而这可能源于其是内生菌作为生防菌的优势。
第1章 绪论
1.1 羊肚菌的研究概况
羊肚菌的外形似羊肚，子实体具有独特的锥形头，表面有凸起和凹陷的褶皱，是最稀有、最受欢迎、价格最昂贵的食用菌之一。羊肚菌具有浓郁的香气、可口的口感和脆嫩的肉质，在许多烹饪应用中备受青睐[1,2]。六妹羊肚菌（Morchella sextelata）是目前流行的菌种，它具有很好的鲜食用菌商业特性。六妹羊肚菌是中国新近人工培育的一种羊肚菌，占羊肚菌栽培总面积的90%以上。六妹羊肚菌属于子囊菌门（Ascomycota）盘菌纲（Pezizomycetes）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌属（Morchella）[3-6]。羊肚菌含有许多重要的营养物质，其主要营养成分包括糖类、蛋白质、生物碱、维生素、游离氨基酸、脂肪酸、多酚类化合物、矿物质和其他营养成分。此外，人工培养的羊肚菌菌丝体被广泛用作调味剂[7,8]。羊肚菌不仅风味独特，营养丰富，而且目前的科学研究已经证实，从医学角度来看它具有抗氧化、抗炎、免疫刺激等药用价值[3,9,10]。食用菌的多糖常被用作抗癌药物，其中羊肚菌多糖可用于治疗皮肤癌和肝癌。它的多糖还可以通过抑制内毒素处理的巨噬细胞中一氧化氮的产生来潜在地调节免疫系统，所以这些多糖可以用于治疗炎症性疾病。羊肚菌多糖作为天然产品在医药和营养行业具有巨大的潜力[11-14]。羊肚菌的经济价值很高，市场需求不断增长。然而，野生羊肚菌自然产量有限，羊肚菌人工栽培技术还不够完善，因此，羊肚菌的产量供不应求[15]。
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1.2 羊肚菌真菌性病害的研究概况
真菌性病害是严重威胁羊肚菌栽培和生长的重要因素，其危害性甚至超过害虫，每年大约有25%的种植区受真菌病害的影响[16-18]。目前，已报道的羊肚菌真菌病害主要包括由丝枝蜡蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）、粉红螺旋聚孢（Clonostachys rosea）和黑曲霉（Aspergillus niger）引起的腐烂病[19-21]；由蟹爪拟青霉（Paecilomyces penicillatus）引起的白霉病[16]；以及由枝葡霉（Cladobotryum mycophilum）引起的蛛网病[22]等。其中，丝枝蜡蚧霉（Lecanicillium aphanocladii）是引起大面积真菌性腐烂病害的重要病原菌，该病的症状是，首先在盖子的表面或顶部出现一小块白色霉菌样损伤，然后，病变发展到围绕菌盖，并逐渐扩散到菌柄。这是一种严重的腐烂病害，其自然发病率为30%，该病害的后期症状是子实体整体呈现软化状态至完全死亡[19]。严重的真菌病害不仅阻碍了羊肚菌人工栽培的发展，也给农民造成了巨大的损失。目前，真菌性病害的防治方法主要以物理方法为主，合理控制温度、湿度，及时通风，人工拔除已侵染病原菌的菌株到棚外销毁等措施[23,24]。虽然已经研究了生防菌病害的化学防治方法，然而，这些农用化学防治剂并非对所有病害都有效。而且，许多杀菌剂对环境有负面的影响，因为它们持续积累在土壤中，甚至渗入地下水，从而污染地下水，化学试剂与人们的过敏、癌症、神经系统疾病等直接相关[25]。抗生素的使用对土壤、水、食品安全、人类健康的损害以及对植物病原菌抗生素的抗药性存在潜在的威胁[26-30]。目前，已经开展了一些关于食用菌生物生防的研究。据报道，蘑菇挥发性1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）在抑制由蟹爪拟青霉引起的羊肚菌病害和提高羊肚菌产量方面具有潜在的作用[31]。然而，到目前为止，对羊肚菌的研究大多局限于病原菌的分离和鉴定，流行性疾病的发生、特点及防控方法的研究和应用较少[10,32]。因此，有必要制定既具有成本效益又绿色生态的新预防和控制策略。
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第2章 生防菌B. subtilis A9的特性研究
2.1 材料和仪器
2.1.1 供试菌株
生防菌菌株A9，由本实验室从健康内生菌中分离得到，已送至中国典型培养物保存中心菌种保藏（保藏号CCTCCNO:M20221704）。
2.1.2 主要试剂和培养基
HBI芽孢杆菌生化鉴定条、V-P试剂盒、硝酸盐还原试剂、卢戈氏碘液等用于生理生化试验的试剂购自青岛海博生物技术有限公司；引物合成及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 液体LB培养基：NaC l 5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g。 固体LB培养基：NaC l 5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，琼脂15g。
2.1.3 主要仪器
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2.2 实验方法
2.2.1 生防菌A9的形态学鉴定
将实验室保存于-80 ℃冰箱的A9菌株甘油冻存管融化，在 LB固体培养基上平板划线（三区划线法），37 ℃培养 24 h。用肉眼观察并记录菌落大小、颜色、形状、边缘和透明度。 LB固体培养基上长出单个菌落后，用接种环挑取单菌落接种于10 mL LB 液体培养基中，28 ℃、200 r/min 培养12 h 获得活化菌悬液。取适量菌悬液于SEM扫描电镜下观察。
2.2.2 生防菌A9的生理生化鉴定
根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，采用HBIG14生化鉴定纸对生防菌A9进行厌氧生长、V-P、柠檬酸盐、丙酸盐、D－木糖、L－阿拉伯糖、D－甘露醇、明胶液化、7％氯化钠生长、PH5.7生长、硝酸盐还原、淀粉水解生化试验。
生防菌A9自-80℃冰箱取出后活化，接种在LB固体培养基中，37℃培养24h后接种至生化鉴定条。使用接种环从LB固体培养基上挑取单个菌落至无菌水中研磨，充分研磨后制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液，加入至V-P、柠檬酸盐、明胶、7%氯化钠、pH5.7、硝酸盐还原、淀粉水解孔内，每孔加入100µL菌悬液；使用接种针挑取菌落垂直穿刺于丙酸盐、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇孔中。
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第3章 生防菌B.subtilis A9对羊肚菌腐烂病的生防效果 ....................... 22
3.1 材料和仪器 ..................................... 22
3.1.1 供试菌株 ............................................. 22
3.1.2 主要仪器设备 ..................................... 22
第4章 生防菌B.subtilis A9对羊肚菌腐烂病的生防机制研究 ............................. 27
4.1 材料和仪器 .................................... 27
4.1.1 供试菌株 ................................. 27
4.1.2 主要仪器设备 .................................. 27
第5章 结果与讨论....................... 39
第4章 生防菌B.subtilis A9对羊肚菌腐烂病的生防机制研究
4.2 实验方法
4.2.1 病原菌L.aphanocladii G1与生防菌B.subtilis A9共培养后SEM观察实验
本研究中使用L. aphanocladii G1与B. subtilis A9在马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA；马铃薯提取物200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L）上进行共培养[78]，并在28°C下生长7天后在SEM扫描电子显微镜下观察，挑取细菌-真菌共培养接壤处的真菌菌丝标记为WT处理组，单独正常培养的真菌病原物G1菌丝作为CK对照组。每个处理 3个重复，重复实验2 次。两个组别均用4℃预冷的2.5%戊二醛溶液进行固定，4°C 冰箱过夜固定，依次放入不同浓度的乙醇（30%、45%、55%、65%、75%、85%、95%）各脱水 20 min处理一次，100%浓度的乙醇脱水20min处理两次，将采用临界点干燥法干燥后的样品均匀撒在电导胶带上，喷金处理后利用 TM-4000 SEM扫描电镜进行观察菌丝形态，分析B. subtilis A9对L.aphanocladii G1的作用方式[79,80]。
4.2.2 转录组测序样本采集
根据盆栽和田间实验结果证实了菌株B. subtilis A9的生防作用，并且生防效果最佳的施用方式是在病害发病前施用菌株B. subtilis A9，在此过程中B. subtilis A9是如何作用于宿主羊肚菌，以及喷施菌株B. subtilis A9后的羊肚菌是如何响应丝枝蜡蚧霉生物胁迫还需进一步研究。本研究从室内盆栽实验中采集了处理T1组（喷施B. subtilis A9的健康羊肚菌）和处理T5组（未经处理的健康羊肚菌对照）的羊肚菌样本，详细观测转录组层面的变化以深入探究菌株B. subtilis A9的作用机制。本实验样本来自实验室盆栽实验室内防效测定同一批次羊肚菌子实体，对每个样本进行了三次生物学重复，取样后，液氮速冻。
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第5章 结果与讨论
许多微生物有能力控制真菌和细菌导致的病害，一些相关的微生物已被证明是有益的且产品已经商业化。其中，生防菌芽孢杆菌具备可以在恶劣的环境条件下在土壤中形成孢子并长期存活的优势。目前，芽孢杆菌属的一些菌株，被用作防治作物病害的生防剂。本研究以分离自羊肚菌的内生枯草芽孢杆菌（B. subtilis） A9作为生防菌，研究其对由丝枝蜡蚧霉（L.aphanocladii）导致的羊肚菌腐烂病害的生防潜力。羊肚菌是一种重要的食用菌，具有很高的经济、营养和药用价值。羊肚菌腐烂病害导致产量锐减，由于人工栽培技术尚未完善，真菌病害造成的损失因而更加严重。近年来，植物内生菌被认为是生防菌和生物接种剂极好的来源，因为它们具有在植物组织内成长、抑制植物病原体、改善细菌定植和促进植物生长的独特能力[90]。然而，关于食用菌内生菌的报道很少，而据我们所知，作为生防菌的食用菌内生菌枯草芽孢杆菌在本研究中尚属首次报道，为完善数据库和进一步探索生防菌做出了贡献。
本研究从羊肚菌内生细菌中分离到的菌株B. subtilis A9在平板对峙实验中对丝枝蜡蚧霉菌L.aphanocladii G1有较强的拮抗作用。室内盆栽试验中对菌株B. subtilis A9进行了安全性评价，单独喷施菌株B. subtilis A9对羊肚菌无明显差异，证明菌株B. subtilis A9作为生防菌的安全性，而这可能源于其是内生菌作为生防菌的优势。在盆栽防效验证实验中，菌株B. subtilis A9表现出较好的生防效果，进一步探索了菌株B. subtilis A9的最优施用方式，实验证明在接种病原物之前施用生防菌B. subtilis A9效果更好，因此推测可能是菌株B. subtilis A9通过竞争生态位以及吸收病原物营养和占据空间方面发挥生防作用。通常在实验室内有良好生防作用的候选菌株，在大田环境下会面临防效不稳定的情况。本研究在田间验证试验中结果表明连作障碍病害田病情指数为84.8%，喷施生防菌防治病害田病情指数为31.8%，B. subtilis A9处理的防效达到了62.5%。结果表明，菌株B. subtilis A9可以作为生防的候选菌株。内生细菌枯草芽孢杆菌作为生防菌的使用为防治羊肚菌腐烂病提供了一种可行的、生态友好的选择。
参考文献（略）