湿热内蕴性结直肠癌与Pi6的相关性研究

时间:2014-11-20 09:44来源:www.020lunwen.com 作者:jingju 点击:
本文为医学论文写作,笔者认为早期结直肠癌发生发展的作用,从而为结直肠癌的早期诊断及治疗做一定的指导。对中西医结合治疗早期结直肠癌起到一定的指导作用。

第一章:临床研究

1.研究目标
通过研究P16在早期结直肠癌组织中的表达,了解其与早期结直肠癌的关系,并与中医证型相结合,观察不同的中医证型ne的表达及其与对照组比较,探讨其相关性,从而为结直肠癌的早期诊断及治疗做一定的指导。

2.研究内容
2.1用免疫组化的方法检测打6在早期结直肠癌组织的表达。

2.2通过检测
早期结直肠癌各中医证型的P16及正常大肠组织中的表达有无差异,来探讨P16在早期结直肠癌发生发展的作用,及与各中医证型的相关性。

3.拟解决的问题

3.1根据患者的临床症状、电子结肠镜镜下诊断,结合舌苔脉象,把纳入的早期结直肠癌的患者进行中医辨证分析,分为湿热内蕴型、脾肾阳虚型。

3.2利用免疫组织化学方法

检测分子生物学指标P16在不同中医证型中的表达,对各型及正常组P16的表达结果及进行分析比较,确定其有无差异,探讨其与早期结直肠癌相关性,并分析P16在早期结直肠癌的发生发展的作用。
资料和方法
1.病例来源
所有的病例均来自2010-2013年间福建省第二人民医院消化内镜室检出的早期结直肠癌患者,使用中医证型筛选表,蹄选出湿热内蕴型20例、脾肾阳虚型20例。另外选择正常对照组20例。
2.诊断标准
2.1西医诊断标准(参照第九届国际治疗内镜、消化疾病学术会议制定的有关标准)A、临床症状:具有便秘,便血(排除痔拖),慢性腹湾,排便习惯改变,排粘液便和间歇性腹痛之中的任何一种或兼有者。
B、经病理诊断为早期结直肠癌的患者。
2.2中医诊断标准(参照大肠癌科研协作会议(杭州1992)所制定的有关标准):湿热内蕴型:腹部阵痛,便中带血,胚门灼热,或里急后重,或恶心,发热,胸闷等。
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4.研究方法

免疫组织化学方法检测P16在细胞中的表达

4.1组织切片、烤片
将石蜡标本连续切成厚度为3Mm的切片2张,在6(rC烤箱中供烤15小时。

4.2切片脱错水化
将石蜡切片浸于松节油中两次,均为10分钟二次。取出切片置于100%无水乙醇中10分钟两次,依次置入90%-85%-75%各级酒精各10分钟,于蒸傾水中水洗5分钟。

4.3抗原修复
切片置于专用切片架上,放入锅内加热15分钟(含枸橼酸缓冲液),冷水冲至室温,取出切片,置于蒸馆水中洗。

4.4过氧化物酶阻断
加3%HA工作液封闭,放入37°C培养箱,10-20分钟,倾去液体。

4.5滴加一抗
每张玻片上分别直接滴加适当浓度的鼠抗人P16抗体,37r孵育30分钟,PBS冲洗3次,每次分钟,取出切片,平放于湿盒中。

4.6滴加二抗
每张切片滴加sort二抗,37°C恒温鮮育30分钟,PBS冲洗3次,平放于湿盒中。滴加链霉素卵白素工作液,37°C孵育30分钟,PBS冲洗3次,每次5分钟。

4.7滴加显色剂(DAB)
滴加新鲜配制的DAB显色工作液,室温孵育5分钟,镜下控制显色程度,冲洗终止显色。

4.8复染、脱水、封片
蒸水冲洗后,用苏木素复染1分钟,切片经梯度酒精75%、85%、95%、100%脱水干燥,各10分钟,中性树脂封片。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

4. 9免疫组化结果判断标准
双盲法阅片,P16以细胞装或胞核内出现棕黄色颗粒。每张切片选择10个典型高倍视野(400X),将细胞着色强度评分:0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。阳性范围:〈5%为0分、5-25%为1分、25-50%为2分、50-75%为3分、>75%为4分。
该片评分为两项之积,0-4分为蛋白表达缺失或降低(阴性),5-12分为中、高度阳性表达(阳性)。

5.统计分析
使用SPSS16.0软件进行数据分析和统计处理。根据实验数据,选用X2检验、单因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。
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第二章:结果

1.各研究组之间年龄、性别比较:
在正常对照组中男性11例,女性9例,平均年龄58.20±14.18;湿热内蕴组中男性8例,女性12例,平均年龄57.05±11.91;脾贤阳虚组中男性12例,女性8例,平均年龄60.10土12.31:结果见表1,结果均无统计学意义(P X).05)。

2.P16在正常大肠组织和大肠癌组织中的表达:
木实验结来显示,1)16在甲.期结直肠癌组织、正常大肠组织屮阳性率分别为35%,、?()%,两纽间比较有统计学意义,认为表达在两组间存在品著性差异(p〈0.01)。

3.P16在早期结直肠癌各中医证型中表达:
P16在不同中医证型的表达见表3,方检验结果:P16在正常对照组、湿热内蕴组、问存在明显性差异(P<0.05)。
早期病变经EMR或者ESD治疗后,一般在半年到一年内复查,前5年每年随访,随访2年未见肿瘤方可认为治愈用EMR、ESD治疗结直肠癌患者,不但可以达到根治的目的,也免除了外科手术的风险和提高了患者的生活质量。当早起结肠癌病变切缘有癌细胞残留或者中度不典型增、结直肠癌细胞浸润至粘膜下层、癌细胞分化程度差,出现上述情况者,需采用外科手术治疗。本实验中的40例早期结直肠癌患者均采取内镜下EMR或ESD治疗,复查预后很好。

2.早期结直肠癌

早期结直肠癌是指病变局限于點膜和點膜下层的癌,这是在临床工作中一直使用的诊断标准。腺瘤是最结直肠癌主要的癌前病变,早期癌的病理基础是正常粘膜的异型增生。早期结直肠癌患者由于缺乏临床症状或者症状不典型,容易与其他肠道疾病相混靖,延误诊治。日本大肠癌协会将早期结直肠癌分为隆起型、表面型、侧方扩散型肿瘤(LST)三型,其中LST容易被忽视,且癌变率高,可分为有颗粒型和无颗粒型两种类型。癌变率分别为26. 7%、47.6%。
结直肠癌的发病率逐年上升,只有提高对早期结直肠癌的诊断率才能降低死亡率,但是早期没有典型症状,因此只有提高蹄查率。导师一般建议年龄超过50以上的中老年患者进行内镜蹄查,特别是近亲中有患大肠癌的人群。最简单也是最被人群接受的方式是粪便隐血实验,普查可降低结直肠癌死亡率30%左右,但是该实验影响因素较多,容易出现假阳性。结肠镜检查是现在结直肠癌的主要检查方式,观察直观,发现癌前病变可以在肠镜下切除,但是受检人群不容易接受,因为费用相比着隐血实验贵,而且肠道准备和做肠镜时的耐受性及出血穿孔也是在人群的考虑范围内。结肠镜下息肉摘除术可降低大肠癌的发病率76%?90%?另外粪便脱落细胞检查、肿瘤标志物检测也是结肠癌的常用检查方式。
在目前的研究中发现,P16基因的纯合缺失是主要的失活机制,除了在神经母细胞瘤没有检测到纯合缺失外,其他肿瘤缺失率25%?82%不等,目前还没有发现其他抑癌基因有如此高频率的纯合缺失。Nakash;Lma_利用反转多聚酶链反应检测宫颈癌和子宫内膜癌,P16低表达。另外Liang等发现结直肠癌患者中P16基因甲基化,其生活质量不高、生存期较短。这也反应了pl6基因的缺失和突变在人类恶性肿瘤中普遍存在。
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第二章结果.......................................................................5
1.各研究组之间年龄、性别比较......................................5
2.  P16在正常大肠组织和大肠癌组织中的表达...............6
3. P16在早期结直肠癌各中医证型中的表达....................6
第三章讨论.......................................................................8
1.对结直肠癌的认识..........................................................8
2.早期结直肠癌.................................................................8
3. P16与结直肠癌.............................................................9
4. P16与早期结直肠癌的中医证型的关系......................10
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第三章讨论

1.对结直肠癌的认识
1.1发病机制
普遍认为结直肠癌的发牛,类型有两种,一种是近来提出的新牛癌(denovo),由腺管发展而来,形态学上表现为表面缺陷或者平坦;第二种就是传统的腺瘤-癌相关学说,这占结直肠癌的60%,均表现为隆起型,病理上皆有腺權期,这1:|(大肠癌60%左右。近年来,Bedenne等分析了1630例大肠癌病理标木,认为大肠的发生有起源于平姐型粘膜和腺瘤的基础上两种方式,其中前者主要表现为浸润型及浸润演病型结直肠癌,后者表现为隆起型和局限淸病型。
结直肠癌是指多种致癌因素如饮食、环境、遗传等作用^^结直肠粘膜后,粘膜发牛病变,预后不良,死亡率高。

1.2发病的主要影响因素
1.2.1.饮食因素:高脂高盐膳食是主要因素。既能导致得肠道厌氧菌数B增加,乂能降解胆汁酸,并可以使多胺限速酶的活性增加,刺激、损伤大肠粘膜,长期反复刺激III导致癌变。次级胆汁酸是结直肠癌的致病因子。在Le Marchand等调杏研究中发现,进食蛋类则会增加忠结宵肠癌的风险。
1.2.2酒精:随着研究的展,人们发现酒精摄入使发生大肠增牛性息肉和腺瘤的机率提高,而它们都是结直肠癌的癌前病变。有结良肠癌呈弱相关性。
1.2.3亚硝酸盐:亚硝酸类物质进入人体/1:?在一定条件下经肠菌作用可还原为亚硝胺,亚硝胺在肠菌作用下,可转化为胼类化合物,成为强致癌物。
1.2. 4.其他:吸烟是结直肠癌发生的高危因素,梁酉等发现烟草中有多种致癌物促癌物,如焦油、尼古丁,它的危险系数与年龄和烟龄呈正相关,烟龄越长,患结直肠癌的风险越高。
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结论
现代医家对结直肠癌积累了不少的经验,并参合前人认识,认为结直肠发病的关键是内虚,与脏腑功能失调和人体内外环境有关。李国栋教授认为正气亏虚是大肠癌发病之本,所以临证遣方必先治其本,在扶助正气的同时兼顾癖、毒、湿、痰的辨治。魏文浩认为结直肠癌的发病多为毒邪致肠络受损所致。毒邪是指七情郁结所产生的病理性毒邪和六淫邪气侵袭人体后产生的火毒。
临床上对结直肠癌缺乏统一的规范,各医家的辨证论治多是根据自己的经验。全国大肠癌科研协作会议把大肠癌分为湿热内蕴型,气血两虚型,脾肾阳虚型,疲毒结阻型,和肝肾阴虚型。大多数学者均将大肠癌辨证分为气滞血癖证、湿热蕴结证、肝肾阴虚证、气血两虚证和脾肾阳虚证五个证型。施志明教授[42]认为肠癌属于本虚标实之证,将本病辨证为湿热蕴结型,脾虚气滞型,癖毒内阻型,肝肾阴虚型和脾肾阳虚型等五个证型。陈乃杰[43]根据自己的临床经验,将结直肠癌分为疲毒内结、湿热下注、脾肾阳虚、气血亏虚和肝肾阴虚型。李忠中将大肠癌辨证分型分为湿热内蕴型,疲毒内阻型,脾肾阳虚型,气血双亏型和肝肾阴虚型。贾小强等将大肠癌辨证为湿热毒蕴型,气血虚弱型,脾肾阳虚型和肝肾阴虚型四型。
在导师的前期研究中,对3年来与福建中医药大学附属第二医院就诊的183例大肠癌患者中发现,临床证型以湿热证最多见,其余为肾虚证、血癖证多见。

参考文献(略)

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