津力达对高脂改善胰岛素抵御鼠骨骼肌脂质沉积作用机制概述

时间:2014-10-21 08:55来源:www.020lunwen.com 作者:jingju 点击:
本文为医学论文写作,临床研究发现,津力达在改善IR的同时能够明显降低患者的血脂水平,因此,津力达增加胰岛素敏感性的机制可能与降低患者血浆甚至骨骼肌组织脂质水平有关。

前 言
 

由于骨骼肌组织是机体能量代谢的主要器官,因此骨骼肌细胞糖脂代谢异常与IR的发生密切相关。研究表明,骨骼肌脂质沉积是IR发生的重要原因。此外,线粒体功能障碍被认为是IR及脂质沉积发病机理的关键因素。目前用于改善T2DM及胰岛素抵抗的药物有双胍类和噻唑烷二酮类等,在临床应用中这些药物均起到了一定作用,但是,大剂量应用均存在一些严重的副作用,特别是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类对心血管的副作用,使得此类药物的应用受到影响。中医药作为祖国传统医学在医学体系中占据重要地位。降糖药物津力达是一种中成药,由人参、黄精、苍术(炒)、苦参、麦冬、地黄等十几味中药制成。临床试验及动物实验证实它能够降低四氧嘧啶和肾上腺素所诱发大鼠的高血糖,调节糖耐量;改善胰腺组织的炎症反应,恢复T2DM患者胰岛β细胞分泌能力;能够降低患者胆固醇、甘油三酯的含量,但是其具体的降糖机制尚不明确。
吡格列酮,噻唑烷二酮类药物,属于PPAR-γ激动剂。研究证实,吡格列酮能够激活骨骼肌组织的5'一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′-AMPactivated protein kinase,AMPK)以及脂联素信号通路,增强线粒体的功能及脂肪酸氧化,减少骨骼肌脂质沉积,改善IR。
因此,本课题以高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠为实验模型,观察中成药津力达对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌脂质沉积的改善,并以吡格列酮作为阳性对照药,深入探讨津力达改善大鼠IR的分子机制。
...................................

材料与方法

1.实验材料

1.1实验动物及饲料:
雄性健康Sprague Dawley(SD)大鼠48只,体重在125–145克,均购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所(许可证号:scxk(京)2009-0017;合格证编号:0270141)。大鼠于河北省人民医院动物实验室分笼饲养,自由进食、饮水,室温20~25℃,相对湿度40-70%,每日12小时光照维持,昼夜循环。动物饲料分为普通饲料和高脂饲料,普通饲料购自河北医科大学实验动物中心,高脂饲料自行配制,配方:面粉10%、豆粕33%、大豆粉20%、鱼粉2%、猪油30%、麸皮2%、骨粉3%,其热量比例为:碳水化合物20.1%、蛋白质20.1%、脂肪59.8%。0.1gBSA加生理盐水100mL溶解,分装后,-20℃保存。考马斯亮蓝染液:100mg考马斯亮蓝G250加入50mL95%乙醇中,完全溶解后再加100mL85%浓磷酸,蒸馏水定容至1000mL,混匀后过滤,4℃保存。

2实验方法

2.1动物模型的建立
48只雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为两组:12只予基础饲料喂养,36只予高脂饲料喂养。基础饲料(由河北医科大学实验动物中心提供),热量组成:碳水化合物65.5%,脂肪10.3%,蛋白质24.2%,总热量为348kcal/100g;高脂饲料为自制高脂饮食,热量组成为:碳水化合物20.1%,脂肪59.8%,蛋白质20.1%,总热量为501kcal/100g。喂养6周后禁食12小时过夜,每组随机取6只大鼠行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验,判断高脂组IR模型造模成功。每组随机抽取6只大鼠,腹主动脉放血处死留取血清,同时留取股四头肌标本,-80℃保存备用。
基础饲料喂养的6只继续予基础饲料作为正常对照组;高脂喂养造模成功的30只进一步分组:高脂对照组,吡格列酮干预组,津力达低、中、高剂量干预组。
.......................

2.2腹腔注射葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)
实验14周末,各组大鼠禁食12小时过夜,次晨首先取一滴鼠尾血测定大鼠空腹血糖(0′血糖),而后予以50%葡萄糖注射液(2g/kg)腹腔注射,分别鼠尾取血测定注射葡萄糖后5分钟(5′),10分钟(10′),30分钟(30′)、60分钟(60′)、120分钟(120′)血糖,并计算葡萄糖曲线下面积(area underthe curve of glucose,AUCglu)。葡萄糖曲线下面积计算公式为AUCglu=(0′+30′)/4+(30′+60′)/4+(60′+120′)/2。

2.3清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验

分别于喂养6周和14周末从各组大鼠中随机选出6只,禁食12小时过夜。第二日清晨,空腹下对大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)使之麻醉,然后从大鼠颈前右侧斜行剪开长约1.5cm左右的切口,对右侧颈静脉及颈动脉进行插管,插入导管长度约为2-2.5 cm,导管经皮下从颈后引出,用肝素(100 U/ml)抗凝封管,最后将导管结扎固定于颈后皮肤。单笼饲养术后大鼠,使之自由摄食、饮水,并注意保暖。待大鼠应激状态消失即恢复正常生理状态后,再次禁食12小时过夜,次晨行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验。为保证取血顺利,于颈动脉导管远端接一支装有肝素生理盐水(50U/ml)的注射器;颈静脉导管通过一三通管连接双通道微量注射泵,一通道内装有胰岛素注射液(40mU/ml),另一通道装有30%葡萄糖
注射液。先取动脉血测定大鼠基础血糖值,待血糖稳定后以4mU/(kg﹒min)的固定速率输注胰岛素注射液,每10分钟监测一次血糖;当血糖降至低于基础值时,开始以914mg/(kg﹒min)的速度输注30%葡萄糖注射液。
.......................

2.4取材于实验

6周及14周末大鼠禁食12小时过夜;次晨空腹状态下,3%戊巴比妥(40mg/Kg)腹腔注射麻醉,称重后腹主动脉放血,分离血清,6周末大鼠测定血清空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)。14周末大鼠测定血清FBG、FINS、脂联素(APN)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA);取血后快速取出股四头肌组织,而后经生理盐水漂净血渍并用滤纸蘸干,直接冰冻用于油红O染色;留取数块股四头肌组织,适当剪碎后放入EP管,将其迅速置于液氮中,转移至-80℃低温冰箱冻存备用。2.5血清指标的测定2.5.1血糖测定:血糖用葡萄糖氧化酶法测定。2.5.2血清胰岛素、游离脂肪酸、脂联素测定:采用大鼠血清ELISA试剂盒测定。2.5.3血脂测定:血清TC、TG利用全自动生化分析仪(HITACHI 7600-110,日本)测定。2.6骨骼肌脂质含量检测2.6.1骨骼肌甘油三酯含量检测:采用GPO-PAP法测定,按照甘油三酯测定试剂盒提供的操作方法进行,方法如下:称取50mg骨骼肌组织,按重量(g):体积(ml)=1:9的比例,加入9倍体积的无水乙醇,冰水浴条件下机械匀浆,2500 rpm常温离心10分钟,取上清液待测。
混匀后37℃保温5分钟,500nm,蒸馏水或者空白管调零,测定各管吸光度值。计算骨骼肌组织中甘油三酯(TG)含量(mmol/gprot):甘油三酯含量=[(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)]×标准品浓度(2.26mmol/L)/待测样本蛋白浓度(mg prot/mL)。2.6.2骨骼肌游离脂肪酸(FFA)测定:采用铜显色法测定,按照游离脂肪酸测定试剂盒提供的操作方法进行,方法如下:准确称取骨骼肌组织重量,按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%的组织匀浆,2500转/分,离心10分钟,取上清组织匀浆待测。分别取玻璃试管进行编号,按照下表对空白管、标准管和测定管加样。
...........................

 前言.......................................11
材料与方法.............................12
讨论.........................................47
结论.........................................50
.........................

讨论

本实验结果表明长期高脂饮食可诱导大鼠出现IR、血脂升高和骨骼肌脂质沉积,津力达干预可以上调骨骼肌组织AMPK通路蛋白以及线粒体脂肪酸氧化基因的表达,最终减少骨骼肌脂质沉积,从而改善大鼠IR。目前治疗糖尿病的药物主要包括口服降糖药和胰岛素,降糖药物主要有双胍类、噻唑烷二酮类、磺脲类、α葡萄糖苷酶抑制剂等。但是,临床应用过程中发现这些药物存在一些副作用,特别是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类对心血管的副作用,使得此类药物的应用受到影响。中医学在其漫长的发展历程中已形成独特的理论体系及治疗方法,近年来在治疗糖尿病方面的优势及疗效不断凸显。津力达,作为一种降糖中成药,主要由人参、苍术(炒)、黄精等十七味中药组成,在临床上广泛用于T2DM的治疗,在我们的研究中发现津力达可以改善高脂饮食诱导的IR。临床研究发现,津力达在改善IR的同时能够明显降低患者的血脂水平,因此,津力达增加胰岛素敏感性的机制可能与降低患者血浆甚至骨骼肌组织脂质水平有关。本研究基于此,设计相关动物实验,从改善骨骼肌脂质沉积角度探讨中成药津力达改善大鼠IR的分子机制。吡格列酮作为噻唑烷二酮类药物,属于PPARγ激动剂,作为胰岛素的增敏剂广泛用于T2DM的治疗。研究发现,吡格列酮能够激活AMPK和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)的磷酸化,上调肉碱脂酰转移酶-1(carnitine palmitoyl transferase-1,CPT1)的表达,促进脂肪酸进入线粒体氧化,从而减少骨骼肌脂质沉积,最终改善IR。Coletta等研究报道,长期应用吡格列酮治疗能够显著增加T2DM患者血浆脂联素水平,骨骼肌组织AMPK、ACC的磷酸化增强,同时编码线粒体功能以及脂肪酸氧化的基因表达显著增加。
........................
 

结论
 

1高脂饮食可诱导大鼠胰岛素抵抗的发生,表现为大鼠空腹血糖、胰岛素水平的升高及葡萄糖输注率下降。津力达干预后可改善高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗,其作用与吡格列酮相当。
2高脂饮食使大鼠血脂升高,伴随骨骼肌脂质沉积,津力达干预下调了大鼠血脂,改善了骨骼肌脂质沉积,津力达降血脂的作用略优于吡格列酮。
3高脂饮食下调了血浆脂联素水平及骨骼肌组织ADIPOR1、ADIPOR2 mRNA的表达,同时下调了AMPK通路蛋白的表达,而津力达干预可改善这一状况,其作用与吡格列酮相当。
4高脂饮食引起线粒体肿胀,线粒体嵴变少变短甚至部分或全部消失,介导线粒体功能和脂肪酸氧化的线粒体基因表达下调,津力达及吡格列酮的干预均可改善这一状况。
基于此,本研究以吡格列酮作为阳性对照药物探讨津力达改善IR的作用机制。
本课题以高脂饮食喂养的肥胖IR大鼠作为模型,这与现代人因高热量饮食摄入增加导致各种代谢性疾病尤其是T2DM的发生机制相符合。
津力达干预8周后显著改善了高脂饮食诱导的IR大鼠的血糖状态:包括空腹血糖、葡萄糖输注率即GIR、曲线下面积即AUC。高脂饮食诱导的IR通常伴有血脂代谢的异常。津力达干预后明显降低了大鼠血清TG、TC和FFA水平,血脂的降低意味着全身能量代谢水平的增加。研究表明,高脂饮食诱导的IR与骨骼肌脂质沉积相关:TG在骨骼肌组织的异位沉积导致大鼠IR的发生,可能与脂肪酸摄取的增加、氧化的减少及酯化的增加相关,而骨骼肌组织脂肪酸氧化的增加会改善IR。本研究中,高脂饮食诱导的大鼠IR伴随骨骼肌脂质沉积(TG、FFA、LCACoA),津力达干预8周后显著改善了骨骼肌组织TG、FFA和LCACoA的积聚,正如油红O染色所示。

参考文献(略)

医学论文网提供医学职称论文


------分隔线----------------------------
发表评论
请自觉遵守互联网相关的政策法规,严禁发布色情、暴力、反动的言论。
评价:
医学论文网联系方式
推荐内容