医学论文代写:SD大鼠毛乳头细胞体外培养及

时间:2017-05-25 16:50来源:未知 作者:医学论文发表 点击:
[摘 要] 目的 了解SD大鼠毛乳头细胞(DPCs)体外培养的生长特性,并用其构建组织工程双层皮肤。方法分离大鼠触须部获取完整毛囊,胶原酶消化获取毛乳头组织,组织块法培养毛乳头细胞

   [摘 要] 目的 了解SD大鼠毛乳头细胞(DPCs)体外培养的生长特性,并用其构建组织工程双层皮肤。方法分离大鼠触须部获取完整毛囊,胶原酶消化获取毛乳头组织,组织块法培养毛乳头细胞并传代。以Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(smoothmuscle actin-α, SMA-α)、CK抗体免疫组化法鉴定细胞,MTT法检测并绘制细胞生长曲线。将第二代DPCs作为真皮种子细胞,角质形成细胞作为表皮种子细胞,用气-液面培养制备组织工程双层皮肤,HE染色观察其组织学结构。结果 成功培养DPCs并传代,Ⅰ型胶原、SMA-α染色阳性;成功构建出含表皮与真皮层的组织工程双层皮肤。结论 体外培养得到的DPCs与表皮结合较好,可作为组织工程皮肤的种子细胞。

  [关键词] 毛乳头细胞 细胞培养 生物学特性 组织工程

    皮肤毛囊(hair follicle)是皮肤重要的附属器官。毛囊细胞可参与创伤的修复与皮肤的愈合[1]。毛乳头细胞(dermalpapilla cells,DPCs)是位于毛囊基底部的真皮源性细胞,它调控着毛囊生长的周期,是毛囊最重要的真皮成分。DPCs在诱导和维持毛球部上皮细胞的生长和分化中起重要作用,可诱导毛囊的再生[2]。笔者通过体外培养大鼠的DPCs,进一步了解了DPCs的生物学特性,成功构建以DPCs为真皮层种子细胞的组织工程双层皮肤,结果报告如下。

  1 材料与方法

    1. 1 试验动物 出生7日龄SD仔鼠2只, 3日龄仔鼠1只,均由第四军医大学实验动物中心提供。
  1.2 主要试剂与仪器 DMEM基础培养液、胶原酶、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司); FAD培养液、SK系列培养液(第四军医大学组织工程中心配制);胎牛血清(杭州四季青),MTT(美国Sigma公司); dispase酶(Gibco);超净工作台(苏州净化总厂), CO2培养箱(德国Heraeus公司) ,倒置相差显微镜(日本Olympus公司)1. 3 实验方法1. 3. 1 DPCs的分离与培养 将7日龄SD仔鼠触须剪短,处死,置于培养皿中。加75%酒精浸泡5 min,剪取触须部皮肤,用含有双抗的PBS液冲洗3遍。体式显微镜下分离毛囊后,将分离的毛囊置离心管中,加入2 mL 0. 25%Ⅰ型胶原酶,置37℃孵箱中消化约60min,待毛乳头从毛母质中松散游离后,轻轻吹打使游离出来。转移毛乳头组织至培养瓶中,加入含4%血清的DMEM培养液(添加100 U/mL双抗), 5% CO237℃孵箱中培养。
  1. 3. 2 毛乳头细胞传代培养 当细胞铺满瓶底的90%时,弃去培养液,加入0. 25%胰蛋白酶消化,待细胞缩成球形加入含血清的培养液终止消化, 800 r/min离心6min,收集细胞,按1∶2传代。
  1. 3. 3 表皮角质形成细胞的分离培养 取3日龄仔鼠背部皮肤约9 cm2,按皮肤纹路剪成宽2 mm的条状, dispase酶(2. 5U/mL)4℃消化过夜。分离表皮与真皮层,胰酶37℃消化5 min,吹打, 200目筛网过滤,1000 r/min离心收集细胞,以1. 0×104/mL密度接种表皮角质形成细胞于培养瓶中。
  1. 3. 4 MTT法绘制毛乳头细胞生长曲线 取生长状态良好的第二代细胞,胰蛋白酶消化,以1. 0×105/mL密度接种细胞至96孔板中,每孔培养液体积200μL,37℃孵箱培养,隔天换液。共分7个样品组,每组5个试验孔。24 h后在第一样品组中每孔加20μL(5 g/L)MTT液,孵育4 h,小心吸弃培养液,加入150μLDMSO液,震荡, 490nm波长读取OD值。同法依次共测7天。以只加培养液的孔作为空白对照,以天数为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
  1. 3. 5 DPCs与表皮细胞的鉴定 取生长状态良好的第2代细胞接种于无菌盖玻片上, 37℃孵箱中培养24h,待细胞在爬片上贴壁、伸展达到一定密度后终止培养,PBS洗涤, 95%乙醇固定40 min。将固定好的细胞爬片用PBS洗涤3次,每次5 min; 2. 5mL/L TritonX-100 37℃处理10 min; PBS振洗3次,每次5 min; 3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min; PBS振洗3次;正常羊血清37℃孵育30 min,甩去血清,滴加1∶150稀释的SMA-α、Ⅰ型胶原、CK抗体, 37℃孵育2h;PBS振洗3次;滴加二抗, 37℃孵育30 min; PBS振洗,DAB显色1-2 min,苏木精衬染胞核1 min;流水冲洗、酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片;染色同时用PBS代替一抗作为空白对照。
  1. 3. 6 组织工程皮肤的构建与培养 取生长状态良好的第二代DPCs,胰蛋白酶消化,以1. 0×105/mL的密度与胶原混合,滴加于铺有尼龙膜的12孔板中,37℃孵育,待胶原凝固后加入FAD培养液;每24 h换液1次;第3天,将生长状态良好的表皮细胞消化离心,以1. 0×105/mL的密度接种于胶原表面,换为SK-1培养液, 3日后换为SK-2培养液,并进行气-液面培养,然后分别使用SK-3、SK-4培养液, 10天后,用4%多聚甲醛固定,HE染色。

  2 结果

    2. 1 毛乳头细胞的分离培医学论文养与传代 胶原酶消化游离出的毛乳头细胞呈圆形或椭圆形(图1)。贴壁后细胞从组织中迁出,呈放射状向四周生长,刚迁出的细胞多呈三角形或多角形(图2),细胞体积较大,传代后细胞呈多角形或梭形(图3);融合后的细胞呈明显的多层化凝集现象,传代后的细胞仍具有这种显著的多层聚集能力。原代培养后约10天可传代,第1代细胞生长约5天后即可传代。经多次传代的DPCs逐渐失去凝集能力,细胞形态逐渐向梭形演变,至第6代时,细胞生长状态逐渐变差,继续培养的细胞开始死亡。
  2. 2 表皮角质形成细胞的分离培养 分离的表皮原代细胞24 h后开始贴壁伸展,细胞体积较间质细胞小。约5天后,细胞融合,铺满培养瓶底壁。融合后细胞呈典型的铺路石状(图4)。
  2. 3 毛乳头细胞生长曲线 细胞在传代后第3天开始增殖活跃,呈对数生长,第5天达到增殖高峰,以后的增殖趋于停滞。细胞生长总体呈“滞缓-对数生长-平台”生长模式,约5天后融合,可传代(图5)。
  2. 4 毛乳头细胞与表皮角质形成细胞的鉴定 DPCs经免疫化学染色,CK抗体呈阴性表达(图6),表明细胞为间充质来源而非上皮;Ⅰ型胶原和SMA-α抗体均呈阳性表达,表明细胞来源均一,均来自真皮乳头,而非真皮鞘(图7, 8)。表皮角质形成细胞免疫化学染色,CK抗体阳性表达(图9)。
  2. 5 组织工程皮肤构建 经气-液面培养的组织工程皮肤肉眼呈粉红色,表面角化明显。HE染色,呈界限明显的真、表皮两层结构,真、表皮结合紧密,表皮层分化层次清晰,分为基底层、棘层、颗粒层和角质层。
  该结构中无毛囊、汗腺等皮肤附属器结构(图10)。

 


 
 

 

  3 讨论

    DPCs作为毛囊最重要的真皮细胞成分,控制着毛发的生长周期,诱导和维持毛球部上皮细胞的生长和分化,控制着毛母质细胞的数量和毛发的粗细[3]。将毛乳头分别与毛囊不同区段的上皮组合,移入肾被膜下培养,分别有不同程度毛囊生成[4]。因此,DPCs的培养近年来受到众多研究者的关注。对DPCs的体外培养研究发现,低传代的DPCs体外培养具有凝集性生长的特征,而经多次传代后则逐渐失去这种能力[5]。吕中法等[6]对DPCs一些因子的表达进行研究,推测高传代(>6)DPCs失去凝集能力与SCF和ET-1的表达阴转有关,而AKIOSADA等[7]用非贴壁培养法培养小鼠DPCs,高传代(>10代)的DPCs仍可以凝集性生长,并可在体内诱导毛囊的再生。
  DPCs缺乏特异的细胞标志,区分DPCs与其它间充质类细胞,主要依赖DPCs的一个特异性生长特征,即多层凝集性生长特性。培养的毛乳头细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)也是该细胞的特征之一。
  但是,由于DPCs的解剖位置特殊,对其分离的难度较大, DPCs的培养只能用组织块法进行。MESSEN-GER[8]提出通过在显微镜下剥离毛囊,获取毛乳头。
  该法需要熟练的显微解剖技术,操作难度及工作量均大,且易污染。伍津津等[9]采用机械分离和酶消化法相结合分离出毛囊真皮乳头组织,成功培养出DPCs。
  本实验采用显微解剖和酶消化法相结合,以处于毛囊生长期的SD仔鼠为材料,成功培养DPCs,并传代。且培养的DPCs无污染,贴壁迅速,具凝集性生长特性,α-SMA组化染色呈阳性表达。Ⅰ型胶原是皮肤真皮的主要组成成分,体外真皮的构建主要是Ⅰ型胶原等细胞间质的合成、重塑过程。体外培养的DPCs能够合成、分泌大量的Ⅰ型胶原[10],可用于重建组织工程皮肤真皮,维持表皮干细胞的未分化状态,从而促进表皮重建。DPCs的以上生物学特性为组织工程皮肤和毛囊器官的重建奠定了良好的理论基础。
  本实验以体外培养的DPCs为真皮种子细胞,覆以表皮角质形成细胞,成功构建出组织工程双层皮肤,与正常皮肤结构类似。说明该法构建组织工程皮肤是可行的。上皮和间充质的相互作用是器官发育的经典途径,而DPCs作为毛囊间质细胞,其对上皮的诱导作用是值得关注的。其构建的组织工程双层皮肤未出现毛囊样的结构,可能与体外的培养条件、培养时间以及诱导微环境有关,或缺少毛囊上皮分泌的相关因子,但该构建模型为未来毛囊化组织工程皮肤的构建提供了良好的思路与方法学基础。

  [参 考 文 献]
  [1] YAMAGUCHI Y, YOSCHIKAWA K. Cutaneous wound healing: anupdate [J]. JDermato,l 2001, 28(10): 521-534.
  [2] ELLIOTTK, STEPHENSON TJ, MESSENGER AG. Differences in hairfollicle dermalpapilla volume are due to extracellularmatrix volume andcell number: implication for the control of hair follicle size and andro-gen response[J]. J InvestDermato,l 1999, 113(6): 873-877.

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