白癜风患者成纤维细胞重编程为诱导多功能干细胞的研究

时间:2017-04-21 21:21来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者首次利用白癜风患者的体细胞重编程出 iPS 细胞,并证明其干细胞功能,为今后利用干细胞治疗及研究白癜风打下基础。
第一章 绪论
 
1.1 白癜风概述
白癜风(vitiligo)是一类局限型或泛发型的色素脱失类疾病,全世界范围内均有一定发病率,约为 0.1%—2%[1],在中国通过大量的人口调查发现具有 0.56%的发病率并且与年龄增长相关[2]。白癜风临床表现为皮损处呈现乳白色伴有明显边缘,在全身各部位均可发生,根据皮损的范围不同可将其分为 3 种类型[3, 4]:1.非节段型,白斑可对称分布于肢端或全身,发病年龄广;2.节段型,白斑呈单侧分布,发病年龄较早,病程快,并且毛囊内黑素细胞早期就会受到影响使毛发变白;3.混合型,是一种特殊的类型,在早期会呈现节段型的特点,随着时间的增加会出现双侧的病变,与非节段型类似。
白癜风的发病机制尚不明确,主要与患处皮肤或粘膜的黑素细胞功能下降甚至丢失相关,近年来的研究表明白癜风的发生可能与以下一些因素有关:1.遗传因素,在同卵双胞胎中均患白癜风的比例为 23%,与红斑狼疮或 1 型糖尿病等自身免疫性疾病在同卵双胞胎中发病率相比较为接近[5],一些基因的突变增加了白癜风的患病风险,如 MTHFR 基因[6],XBP1 基因[7]等;2.免疫因素,患有白癜风的病人往往伴发着一些其他的自身免疫性疾病,如 1 型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎等,固有免疫调节基因 NALP1 在白癜风中发生异常[8],自然杀伤细胞可以渗入到病人的健康皮肤处,使非患处的皮肤也产生免疫反应[9],同样在白癜风患者的血液和皮损处发现了大量的 CD8 阳性 T 细胞,这种细胞在体外可以杀死正常黑素细胞[10],另外还发现了抗黑素细胞表面抗原的抗体,病情严重程度与其滴度相关;3.氧化应激反应,细胞蛋白质的功能会随着氧化应激反应的发生有着不同程度的改变,而与黑素合成相关的酪氨酸酶相关蛋白 1(tyrosinase related protein1,TRP1)的功能会受到抑制[11],早期头发灰白的人群更易患白癜风可能说明了氧化应激反应对毛囊内的黑素干细胞也具有一定的影响[12];4.黑素细胞自身破坏,一些化学物质使黑素细胞分泌特定的抗原以及相关损害分子,如热休克蛋白 70 导致黑素细胞破坏,使白癜风小鼠模型病情加重[13],所以近年来白癜风患病率增加也可能与接触某些化学物质有关;5.神经精神因素,白癜风的发生可能与患者精神紧张、过度劳累等引起儿茶酚胺分泌过多有关系,儿茶酚胺及代谢产物的增加会使黑素细胞功能下降或受到抑制。
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1.2 诱导多功能干细胞概述
ES 细胞是由 Thomson[25]从人胚胎中分离出来的一类全能性的细胞,具有无限增殖的能力,在基因治疗、再生医学、疾病模型的建立方面都具有巨大的价值,但是由于来源的特殊性使其存在着伦理方面的争议,在这一问题上 iPS 细胞具有很大的优势。因为 iPS 细胞不但具有 ES 细胞的特性,而且来源很广泛,目前已有多种细胞都被证明可以重编程为 iPS 细胞,比如成纤维细胞[24]、淋巴细胞[26]、神经前体细胞[27]、肝脏细胞[28]、角质形成细胞[29]、尿液细胞[30]等,同时人[31]、小鼠[32]、大鼠[33]、猪[34]、猕猴[35]等物种也建立了细胞系,起始细胞来源和物种的广泛性使其能在更多的方面被应用。
利用 iPS 技术在疾病的研究及治疗方面也有一定的价值,特别是病人来源的iPS 细胞。ES 细胞由于来源于异体,在进行治疗时会产生免疫排斥反应,而 iPS细胞则可直接来源于病人自体,通过基因修饰等手段修复细胞,再将其分化为相应的细胞、组织甚至器官,在移植治疗时不会存在排斥问题。iPS 细胞还可以用来建立疾病模型以及药物筛选,George Daley 小组[36]利用高雪氏症(Gaucher disease)、21 三体综合征(Down syndrome)、帕金森病(Parkinson disease)、亨丁顿舞蹈症(Huntington disease)等病人的体细胞重编程出 iPS 细胞,并且带有相应疾病的特征,这些病人的 iPS 细胞能够用来建立不同的疾病模型来进行病因研究和制定治疗方案,Lionel Larribere 等人[37]用 I型多发性神经纤维瘤病人的 iPS 细胞建立出模型,并且利用这样的疾病模型研究得出了 NF1 基因的丢失会使人黑素细胞趋向衰老状态的结论。在心脏疾病[38]、肝脏疾病[39]、血液疾病[40]、眼部疾病[41]、线粒体疾病[42]等方面也有用其病人 iPS 细胞制造出疾病模型并进行治疗及机制研究的成果出现。
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第二章 重编程白癜风患者诱导多功能干细胞
 
iPS 细胞首次由日本科学家 Yamanaka 团队研究出来,与 ES 细胞具有极高的相似性,并且可以实现将成体细胞去分化为多功能干细胞,是一项在临床应用研究中具有长远意义的技术。病人由来的 iPS 细胞近年来不断被制作出来,可以实现自体细胞移植治疗以及疾病模型建立等,所以病人的 iPS 细胞研究拥有极大的研究空间。本实验首次利用白癜风患者皮损处成纤维细胞 (vitiligo lesional fibroblast,VLF),通过过表达四种转录因子 OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC 获得白癜风患者 iPS细胞 (vitiligo patient specific-iPS cells, VP-iPSCs)。
 
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 标本信息
白癜风白斑组织来源于江苏大学附属医院皮肤科 2 例,健康状况良好,术前均签订知情同意书,并经医院伦理委员会通过。具体病人信息如下

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2.2 实验步骤
2.2.1 VLF 的分离、培养
1) 外科无菌条件下取皮损皮肤组织,用 PBS 反复漂洗 2-3 次;
2) 将漂洗后的组织剪碎成 1mm3小块放至 10cm 培养皿中,放置均匀,加入 1ml成纤维细胞原代培养基,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养 2 小时;
3) 灭菌后的盖玻片盖于组织块上,滴加 3-4ml 原代培养基,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养,每 3-4 天添加一次原代培养基,每次添加 2ml;
4) 第 10-15 天观察到成纤维细胞爬出后,每 2-3 天全量换液;
5) 待 80%克隆均密集生长后,将盖玻片用镊子取出,翻面置于六孔板中,用 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化培养皿及盖玻片上的细胞进行传代。
2.2.2 VLF 的传代、冻存和复苏
2.2.2.1 VLF 的传代
1) 当细胞长满皿底 80%左右时,弃培养基,用 PBS 反复洗 2 遍,加入预热的 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 溶液后,轻摇培养皿,使胰酶与细胞表面充分接触,放置 37℃,5%CO2培养箱消化 3 分钟左右。取出培养皿,轻拍皿壁,倒置显微镜下观察部分细胞脱落,立即加入 10%FBS-DMEM 培养基终止消化。反复轻轻吹打,避免产生气泡。收集细胞于离心管中;
2) 离心 1000rpm/5min,弃上清;
3) 后将 10%FBS-DMEM 培养基加入细胞沉淀重悬并计数,按 1:2 或 1:3 进行传代,置于 37℃,5%CO2培养箱中继续培养,次日换液,显微镜下观察细胞形态并拍照记录。
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第三章 白癜风患者诱导多功能干细胞鉴定...................... 26
3.1 实验材料与试剂 ..................................... 26
3.1.1 主要仪器 .......................................... 26
3.1.2 主要耗材 ........................................... 27
3.1.3 主要试剂 ........................................... 27
第四章 结论、创新与展望................................ 47
4.1 结论 ................................................ 47
4.2 创新性 ................................................ 47
 
第三章 白癜风患者诱导多功能干细胞鉴定
 
白癜风患者皮损处黑素细胞被破坏,造成色素脱失,具体机制尚不明确。利用白癜风患者诱导多功能干细胞可以建立疾病模型,研究皮肤微环境对黑素细胞影响,或者利用病人干细胞诱导分化成黑素细胞,研究是否黑素细胞本身带有缺陷,针对不同病因学结果提出个性化的治疗方案,在未来具有长远意义。iPS 细胞与 ES 细胞极其相似,不仅表现在形态学方面,同时还表现在表观遗传学方面。本章对白癜风患者 iPS 细胞进行功能方面的鉴定工作。
 
3.3 实验结果
3.3.1 碱性磷酸酶染色
VP-iPS 细胞培养至第 5 代进行染色后在显微镜下观察,与 ES 细胞相似,未分化的细胞会被碱性磷酸酶染成紫红色(图 3.1)。
3.3.2 干性因子免疫荧光染色鉴定
VP-iPS 细胞培养至第 6 代时进行免疫荧光染色鉴定,检测干细胞表面标记物基因蛋白表达情况,在荧光显微镜下观察显示,干细胞表面标记物 OCT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4 均呈阳性表达,染色采用共定位方法,其中前两者属于核定位呈现红色荧光,后两者属于膜定位呈现绿色荧光,由于 DAPI 染核颜色为蓝色,所以与红色核定位荧光合并至一起为紫红色(图 3.2)。
3.3.3 荧光定量 PCR 检测外源性四因子基因表达
重编程过程借助了过表达四因子的作用,使终末分化的成体细胞变化为干细胞状态,外源性转录因子的沉默是重编程过程的关键,使 iPS 细胞在以后的分化过程中不受外源性转录因子的影响。两个病人的 VP-iPS 细胞在培养至第 7 代时进行检测,以加入病毒后第 2 天的病人成纤维细胞作为阳性对照,未加病毒的病人成纤维细胞作为阴性对照,与阳性对照比较 mRNA 表达量明显下降,与阴性对照比较表达量无明显差异,见图 3.3(P<0.01),ES 细胞中外源性四因子基因无表达含量,与 VP-iPS 细胞相似。
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第四章 结论、创新与展望
 
4.1 结论
本研究利用白癜风患者皮损处成纤维细胞重编程出诱导多功能干细胞,采用的方法为过表达四种转录因子,即 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc。分别从形态学、表观遗传、畸胎瘤形成等方面对重编程出的细胞进行了鉴定,主要结论如下:
功能学方面鉴定 VP-iPS 细胞,碱性磷酸酶染色显示细胞为未分化状态,在蛋白质及 mRNA 表达水平检测显示干细胞相关基因均高表达,并且干性基因 OCT4 的启动子区域为去甲基化状态;
染色体核型分析显示 VP-iPS 细胞核型正常,在畸胎瘤形成实验中证明VP-iPS 细胞具有向三个胚层分化的能力。
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参考文献(略)
 
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