LPS 在大鼠肝星状细胞介导肝纤维化的作用及机制研究

时间:2017-04-14 20:08来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者在相关研究基础上,通过建立内毒素 LPS 致肝损伤动物模型,以期进一步阐明内毒素 LPS 单因素在正常大鼠HSC 介导肝纤维化中的作用及机制。
第 1 章 绪        论 
 
1.1 引言
肝纤维化是一种高度复杂的病理生理反应,是各种慢性肝病进展的重要阶段。肝细胞发生受损后,导致变性、坏死及炎症细胞浸润,肝脏库普弗细胞(Kupffer cells, KC)激活并释放细胞因子,肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)活化为肌成纤维样细胞表达 α-SMA 同时释放细胞因子,使细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)合成、降解失衡,最终形成肝纤维化。近年来随着对肝纤维化发病机制及防治的深入研究,内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在肝纤维化发生学中的作用倍受关注。近来研究表明,多种慢性肝病伴有不同程度的肠源性内毒素血症[1],然而内毒素 LPS 导致肝损伤的确切机制现尚未完全阐明。Toll 样受体(Toll-like receptors, TLRs)是机体免疫应答信号通路中的一类受体,参与机体的炎症反应,其中 TLR4 作用尤为重要。动物及人体研究证实,内毒素 LPS 与 TLR4 结合,进而激活 MyD88 依赖性或非依赖性信号传导通路,与肝纤维化的发生与发展关系密切。最近,我们通过对 SD 大鼠尾静脉反复注射外源性内毒素 LPS 制造了内毒素肝损伤模型,以期进一步阐明内毒素 LPS 单因素在HSC 介导肝纤维化发生中的作用及机制。本研究证实,HSC 和 KC 均可表达 TLR4 受体,在体内炎症反应起了关键的调节作用。内毒素 LPS 与 TLR4 结合后,激活肝脏 HSC和 KC,产生致炎因子 IL-1、IL-6、TNF-α 和纤维源性因子 TGF-β1,启动炎症的级联反应,导致肝组织炎症反应和纤维化改变;此外,在体外的研究显示 LPS-TLR4 信号通路通过下调 TGF-β1 伪受体 Bambi 表达,增加 HSC 对 TGF-β 介导的信号传导的敏感性。现已证实肝损伤情况下易导致肠源性内毒素血症发生,而内毒素血症的发生进一步加重肝损伤程度,导致肝纤维化发生或进展。由此可见,针对内毒素血症的治疗有望成为解决慢性肝病进展的一个重要环节,为慢性肝病患者带来新希望。
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1.2 文献综述
肝纤维化是多种慢性肝病进展为肝硬化甚至肝癌的重要环节,可由多种致病因素引起。我国以病毒性肝炎为主,尤其乙型或丙型肝炎常见,西方国家以酒精因素最多。肝纤维化形成是细胞外基质(Extracellular, ECM)合成和降解失衡的结果,其中肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活是其发生的关键环节。近来研究表明,多种慢性肝病伴有不同程度内毒素血症发生[1],且内毒素(lipopolyssacharide, LPS)在各种因素致肝纤维化发生中发挥重要作用。最近我们的研究表明:在慢性酒精摄入大鼠模型中,血浆 LPS 水平与肝 HSC 激活及肝组织纤维化程度相关[2]。然而,LPS-TLR4 信号通路在肝脏疾病发生中的确切机制尚未完全明确。本文拟就 LPS-TLR4 信号通路在肝脏传导特征,HSC 激活及肝纤维化发生中的作用及机制做如下综述。
1.2.1 内毒素血症与肝损伤形成
正常情况下,肠道是营养物质消化吸收的场所,同时也是机体内的储菌场所和内毒素库。健康的肠道微生态环境起着屏障功能,可抵御微生物的侵害、阻止肠腔内的细菌移位及肠道内毒素吸收[1-3]。即使少量的肠道内毒素或细菌成分经受损肠黏膜入血,其中 80%-90%可被肝组织中库普弗细胞(kupffer cells,KC)清除,以维持机体的免疫稳态,避免引起肝损伤[4]。各种理化因素导致肠黏膜屏障功能受损,肠壁通透性增加,加之菌群失调,G-杆菌过度增殖并移位入血,门静脉内毒素水平升高。一方面内毒素可直接损害肝细胞,另一方面内毒素可激活肝 KC 和 HSC,进而释放一系列炎性及纤维源性细胞因子引起肝损伤[6-7]。
1.2.2 TLR4 与其配体的结构特征、分布及功能
Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)属模式识别受体家族,是机体免疫应答信号通路中的一类受体,最早于果蝇体内发现[8]。迄今为止,在人类及其他哺乳动物中发现 13种 TLRs,目前认为是哺乳动物体内识别胞外抗原信息并将其转化传递至胞内,进而引发炎症反应的关键跨膜蛋白。TLRs 胞外区均含有特异性识别病原相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的高度保守的富含亮氨酸重复序列,借此与其辅助受体结合形成受体复合物,激活细胞内下游信号通路,将识别的抗原信息传递至胞内[9-11]。胞内区包含 TLR 与下游信号分子作用的 Toll/白细胞介素-1 受体(Toll-interleukin 1 receptor, TIR)同源结构域,是介导下游信号传导的核心作用元件。
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第 2 章 LPS 在正常饮食大鼠肝脏炎症和纤维化发生中的作用 
 
2.1 实验材料
2.1.1 实验仪器
冰冻切片机 湖北欧美莱公司
MB80 检测系统 北京金山川科技公司
普通/荧光显微镜 DP73 Olympus,日本
荧光定量 PCR 仪 ABI Prism  7000,美国
恒温箱 上海和晟公司
酶标仪 Life technology,美国
低温冰箱 青岛海尔集团液氮罐 北京
2.1.2 实验试剂
Lieber-DeCarli 液体饲料 南通特洛菲饲料公司
异氟醚 河北九塔制药公司
10%中性福尔马林 北京九州天瑞公司
伊红 北京鼎国昌盛生物公司
苏木精 北京鼎国昌盛生物公司
碘酸钠 北京鼎国昌盛生物公司
硫酸钾铝 北京化工厂
柠檬酸钠 北京化工厂
甘油 北京鼎国昌盛生物公司
冰醋酸 北京化工厂
丽春红 北京鼎国昌盛生物公司
酸性复红 北京鼎国昌盛生物公司
苯胺蓝 北京鼎国昌盛生物公司
磷钼酸 北京化工厂
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2.2 实验方法
2.2.1 动物模型的建立
将吉林大学实验动物中心提供的 24 只 SD 雄性大鼠(体重 120±20g),随机分为 2组:正常对照组(n=12)与内毒素组(n=12)。Lieber-Decarli 配方的液体饲料喂养至10 周。8 周起内毒素组每周末经尾静脉注入 LPS 一次(3mg/kg),共 3 次,同时对照组注射生理盐水 1ml。10 周末最后一次 LPS 注射 24h 后,两组大鼠采用异氟烷麻醉后,抽取门静脉血,留取肝脏组织块 4 块。取其中一块大鼠肝脏组织经常规福尔马林固定,石蜡包埋后切片(每片厚 3.5μm)用于免疫组化检测。剩余肝组织块于液氮罐中冻存备用。采集大鼠门静脉血分别置于血浆分离管或血清分离管中,以 3000rpm/min,4℃,8min 离心后得到血浆或血清,-80℃冻存,分别用于血浆 LPS 水平或其它 ELISA 的检测项目。
2.2.2 大鼠肝组织 HE 染色
(1)吹风机至 60-70℃,吹片溶蜡 30-40s;脱蜡水化(二甲苯 1、2 各 15min,100%、100%、95%、80%、70%、50%梯度酒精各 5min,流水冲洗 5min;(2)苏木精染色 2min后流水冲洗 30s,盐酸酒精分化数秒,流水冲洗 5min;(3)伊红染色 5min,流水冲洗5min;(4)梯度酒精脱水、二甲苯透明(50%、70%、80%、95%、100%、100%酒精各 2min,二甲苯 1、2、3 各 2min);(5)中性树胶封片,镜下观察,采集图片,避免气泡产生。
2.2.3 大鼠肝组织苯胺蓝胶原染色
(1)吹风机 60-70℃吹片溶蜡 30-40s,脱蜡水化(二甲苯 1、2 各 15min,100%、100%、95%、80%、70%、50%梯度酒精各 5min,流水冲洗 5min;(2)丽春红染色 20s;(3)0.2%冰醋酸 1、2 各 10s;(4)1%磷钼酸分化 5min;(5)苯胺蓝染色 10min;(6)0.2%冰醋酸 1、2 各 10s;(7)梯度酒精脱水、二甲苯透明(95% 1min、100%、100%各 2min,二甲苯 1、2、3 各 20s);(8)中性树胶封片,镜下观察,采集图片,避免气泡产生。
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第 3 章 LPS 在 TGF-β1 作用下大鼠 HSC 介导肝脏纤维化发生中的作用及机制...............25
3.1 实验材料 ........................................................... 25
3.1.1 实验仪器 ........................................................... 25
3.1.2 实验试剂 ............................................................ 25
第 3 章 LPS 在 TGF-β1 作用下大鼠 HSC 介导肝脏纤维化发生中的作用及机制............25
3.1 实验材料 ............................................................ 25
3.1.1 实验仪器 ......................................................... 25
3.1.2 实验试剂 ............................................................ 25
第 4 章 结 论......................................................35
 
第 3 章 LPS 在 TGF-β1 作用下大鼠 HSC 介导肝脏纤维化发生中的作用及机制  
 
3.1 实验材料
3.1.1 实验仪器
倒置生物显微镜 Olympus,日本
-80℃冰箱 SANYO,日本
蛋白垂直电泳槽 Bio-rad,美国
高速离心机 Eppendorf,德国
恒温 CO2 细胞培养箱 Thermo Fisher Scientific,美国
半干式转印仪 Bio-rad,美国
3.1.2 实验试剂
DMEM 细胞培养基 Gibco Life Technologies 美国
FBS(胎牛血清) Gibco Life Technologies 美国
青-链霉素双抗 Gibco Life Technologies 美国
DMSO(二甲基亚砜) Sigma,美国
0.25%胰酶-EDTA Gibco Life Technologies 美国
Tween-20(吐温 20) 北京鼎国昌盛生物公司
30%丙烯酰胺 北京鼎国昌盛生物公司
DTT(二硫叔糖醇) 北京鼎国昌盛生物公司
Tris(三羟甲基氨基甲烷) GENVIEW,美国
Glycine(甘氨酸) GENVIEW,美国
SDS(十二烷基硫酸钠) 北京鼎国昌盛生物公司
考马斯亮蓝 R-250 北京鼎国昌盛生物公司
3.1.3 主要试剂配制
(1)10%AP:称取过 0.05gAP,超纯水定容至 500μl,现用现配。
(2)10% SDS:称量 5gSDS,超纯水定容至 50ml,50℃水浴溶解后室温保存。
(3)Tris-HCl 1.5M(pH8.8):称取 18.16gTris,超纯水定容至 100ml,浓盐酸调 pH值,室温保存。
(4)Tris-HCl 0.5 M(pH 6.8):称取 15.14gTris,超纯水定容至 200ml,浓盐酸调pH 值为 6.8 后,用蒸馏水定容至 250ml,室温保存。
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第 4 章 结 论
 
HSC 在正常生理状态下处于静息状态,在病理状态下 HSC 可被激活在肝纤维化形成过程中发挥关键作用。TGF-β1 是一种强有力促进纤维化发生的细胞因子,可刺激静止型 HSC 转化为肌成纤维样细胞表型的激活状态,进而表达 α-SMA,分泌大量 ECM,同时分泌 TIMP-1 抑制其降解,引起肝纤维化[63]。HSC 活化还可自分泌 TGF-β1 来维持和促进自身持续激活,诱导肝纤维化形成。TGF-β1 参与纤维化过程主要通过TGF-β/smad 通路。在受到外界刺激时 TGF-β1 与相关细胞通过受体结合形成功能性的异源三聚体。随后激活受体调节 Smad2、3,将信号由细胞外传导至细胞内,与相应的靶基因结合后调节相应的功能性蛋白合成从而诱导纤维化生成,其中任一个环节受到抑制皆可影响 TGF-β 促纤维化形成[68]。有研究表明,在酒精刺激下 KC 和 HSC 会产生血管紧张素 II,后者反过来也可以促进 HSC 增殖以及刺激 TGF-β1 的合成,同时血管紧张素 II 可通过增加 smad2 水平增强 TGF-β1 信号通路来达到促肝纤维化的作用[69]。
TGF-β1 通过作用于 HSC 膜上 TGF-β 受体,使静止态的 HSC 活化。然而,在静止的 HSC 研究发现,TGF-β1 对静止的 HSC 作用甚弱,其原因在于静止的 HSC 可高表达TGF-β1 伪受体 Bambi,其通过与 HSC 膜的 TGF-β1 受体竟争进而使 TGF-β 信号传导通路受到抑制[66]。另有研究认为,Bambi 的作用不仅是与 TGF-β 受体结合而使其失去活性,也可以直接作用于 smad7 从而干扰 TGF-β 受体,导致 TGF-β 信号通路受到抑制[70]。Bambi 被抑制后允许 TGF-β 受体充分激活并使相关细胞对其的作用变得更加敏感。研究肝纤维化时发现:在 LPS 刺激下 bambi 表达下降,HSC 对 TGF-β1 作用敏感性增强[71]。
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参考文献(略)
 
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