Irisin 对胰岛 β 细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

时间:2017-04-10 22:39来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者研究采用体外培养胰岛 β 细胞 INS-1 细胞株,检测 irisin 是否可促进 INS-1 胰岛细胞增殖,并探讨 irisin 促进其增殖的相关机制。
第一部分
 
前 言
胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)和胰岛 β 细胞功能障碍是 T2DM 的主要发病机制。其中,胰岛 β 细胞在 T2DM 的发病过程中起着至关重要的作用。因为当 β 细胞仍有足够的代偿能力时,单纯的 IR 并不能导致糖尿病的发生。在 T2DM 发病过程中,当机体出现外周 IR 时,胰岛首先会通过提高 β 细胞分泌功能或 β 细胞数量,来增加胰岛素的合成和释放,以纠正由 IR 引起的血糖水平的升高。当胰岛 β 细胞的数量减少到一定程度,增加的胰岛素不能代偿 IR 时,机体才表现出葡萄糖耐量受损,并最终发展为 T2DM。因此,维持一定的胰岛 β 细胞的―量‖是保证其代偿能力的必要条件[1]。研究表明,骨骼肌是一种内分泌器官,它可以合成和分泌多种细胞因子和活性多肽,这些因子被称为肌肉因子(myokines)。肌肉因子以自分泌、旁分泌或内分泌的形式,作用于骨骼肌自身以及脂肪组织、肝脏、骨骼和大脑等其他组织,从而对机体的整体代谢进行调节[2,3]。Irisin 是新近发现的一种肌肉因子,同时也是一种脂肪细胞因子[4,5]。Irisin 可增加白色脂肪组织解耦联蛋白 1(Uncoupling Protein 1, UCP1)的表达,使白色脂肪组织褐色化,增加脂肪组织生热作用以及能量消耗[4],具有减重,改善胰岛素抵抗及降低血糖的功能。
研究发现,irisin 具有促进细胞增殖的作用。用 irisin 处理人脐静脉内皮细胞后,3H-胸腺嘧啶的摄入明显增加,同时细胞计数明显增加,且细胞增殖抗原标记物(Ki67)表达增加,表明 irisin 促进人脐静脉内皮细胞的增殖,维持内皮细胞数量的稳态[6]。另外 irisin 可通过信号转导子与转录活化子 3(Signal Transducers and TranscriptionActivators 3, STAT 3)信号转导通路促进小鼠海马神经元细胞 H19-7 的增殖[7]。Irisin若是可以促进胰岛 β 细胞的增殖,维持 β 细胞数量的稳定和平衡,将对 T2DM的治疗具有重要的意义。因此本部分研究采用体外培养胰岛 β 细胞 INS-1 细胞株,检测 irisin 是否可促进 INS-1 胰岛细胞增殖,并探讨 irisin 促进其增殖的相关机制。
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1 材料与方法
 
1.1 材料
1.1.1 实验细胞
大鼠胰岛瘤细胞(INS-1 细胞)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂
试剂名称 生产厂家
RPMI-1640 培养基 美国 Hyclone 公司
胎牛血清(FBS) 美国 Hyclone 公司
100×青-链双抗 美国 Hyclone 公司
0.25%胰酶 美国 Gibco 公司
DMSO 美国 Sigma 公司
Irisin 蛋白 美国 Phoenix 公司
兔源性 ERK 单克隆抗体 美国 cell signaling 公司
兔源性磷酸化 ERK 单克隆抗体 美国 cell signaling 公司
兔源性 P38 单克隆抗体 美国 cell signaling 公司
兔源性磷酸化 P38 单克隆抗体 美国 cell signaling 公司
U0126 美国 cell signaling 公司
SB203580 美国 cell signaling 公司
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗 上海碧云天生物技术有限公司
CCK-8 试剂盒 日本同仁公司
Tween-20 美国 Sigma 公司
Tris 碱 美国 Sigma 公司
甘氨酸 武汉博士德生物工程公司
蛋白提取试剂盒 武汉博士德生物工程公司
BCA 蛋白定量试剂盒 武汉博士德生物工程公司
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2 结 果
2.1 INS-1 细胞形态观察
倒置相差显微镜下观察 INS-1 细胞可见:细胞贴壁生长,呈多边形和不规则形,胞体周围有小突起,排列紧密(图 1-1)。
2.2 不同浓度的 irisin 对 INS-1 细胞增殖的影响
分别用 0、40、60、80、100、150 ng/ml irisin 作用 INS-1 细胞 12 h 后,通过 CCK-8检测 INS-1 细胞的增殖情况。结果显示,与对照组(0 ng/ml)相比,irisin 干预后的INS-1 细胞 OD 值明显增加(P<0.05);当 irisin 浓度为 100 ng/ml 时,INS-1 细胞 OD值升高最显著(P<0.05);150 ng/ml irisin 浓度时 INS-1 细胞 OD 值与 100 ng/ml 时差异无统计学意义(P>0.05)。提示 irisin 可以促进 INS-1 细胞的增殖,且其最佳作用浓度为 100 ng/ml(图 1-2)。
2.3 irisin 不同作用时间对 INS-1 细胞增殖的影响
用 100 ng/ml 的 irisin 分别作用 INS-1 细胞 0、6、12、18、24、48 h,通过 CCK-8检测细胞增殖程度,探讨 irisin 作用于 INS-1 细胞的最佳时间。结果显示,irisin 作用24 h 时,INS-1 细胞 OD 值最高(P<0.05),48 h 时细胞 OD 值与 24 h 时无明显区别(P>0.05)。提示 irisin 作用于 INS-1 细胞的最适宜时间为 24 h(图 1-3)。
2.4 irisin 对 INS-1 细胞内 ERK 和 P38 MAPK 磷酸化水平的影响
用 100 ng/ml irisin 干预 INS-1 细胞 24 h 后,通过 western blot 检测 INS-1 细胞内p-ERK 和 p-P38 的水平。结果显示,与对照组相比,irisin 干预后的 INS-1 细胞中,p-ERK 和 p-P38 水平显著增加(P<0.05);分别用 ERK 的抑制剂 U0126 和 P38 MAPK的抑制剂 SB203580 预处理后,p-ERK 和 p-P38 蛋白水平明显下降(P<0.05)。提示irisin 可以激活 ERK 和 P38 MAPK 信号通路(图 1-4,图 1-5)。
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第二部分.................................................23
前 言.................................................23
1 材料与方法..........................................24
1.1 材料..........................................24
1.2 主要溶液的配制..............................24
2 结 果............................................................28
2.1 irisin 对高糖诱导的 INS-1 细胞凋亡的影响...............28
2.2 irisin 对高糖诱导的 INS-1 细胞 GSIS 的影响...............29
 
第二部分
 
前 言
最新发现的肌肉因子 irisin 可以使糖尿病小鼠体重减轻,改善胰岛素抵抗,降低血糖[6,7]。在 T2DM 患者中血清 irisin 水平明显降低[8-10],且在正常糖耐量人群中,血清 irisin 水平与 β 细胞功能指数 HOMA-β 密切相关[11],猜测 irisin 可能对维持胰岛 β的细胞功能具有重要作用。增加血清 irisin 的水平是否可以保护胰岛 β 细胞功能值得探讨。研究表明irisin也具有保护细胞的功能,irisin可通过ERK、AMPK-PI3K-Akt-eNOS信号通路,抑制高糖诱导的血管内皮细胞的凋亡,改善内皮细胞功能[12-14]。Irisin 还可通过抑制氧化应激、炎症反应保护棕榈酸诱导的肝细胞的损伤[15]。但是 irisin 能否抑制高糖环境下胰岛 β 细胞的凋亡尚不清楚。因此本部分研究通过高糖诱导 INS-1 细胞的损伤后,探讨 irisin 对 INS-1 细胞凋亡情况的影响及其相关机制。
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3 讨 论
众所周知,胰岛 β 细胞功能障碍是 T2DM 发病的主要机制之一。高血糖是糖尿病的主要病理生理变化,而长期高血糖可导致 β 细胞功能损害,胰岛素分泌能力下降,即慢性葡萄糖毒性作用。由 β 细胞凋亡导致的胰岛功能受损在 T2DM 发病过程中所起的作用已受到越来越多的重视。科学合理的运动是 T2DM 早期治疗重要的生活干预方式之一,在 T2DM 的治疗过程贯穿始终。研究表明运动可以增加胰岛素敏感性,降低血糖,延迟胰岛 β 细胞的凋亡,改善胰岛功能[16-18]。但是关于运动和改善糖尿病之间的机制尚不清楚,最新发现的由肌肉组织分泌的肌肉因子 irisin 可能是联系运动和代谢的桥梁。
Irisin 是 III 型纤连蛋白组件包含蛋白 5(fibronectin type III domain-containingprotein 5,FNDC5)在切除 N 端信号肽后,经蛋白水解酶裂后形成的多肽片段。过氧化物酶体增殖受体 γ 辅激活因子 α(peroxisome proliferators-activated receptor γcoactivator 1 alpha,PGC1-α)在肌肉中的表达可刺激肌肉中 FNDC5 的表达[6]。人体内白色脂肪组织主要作用是能量储存,以及分泌多种脂肪细胞因子及炎症因子参与胰岛素抵抗及相关疾病的发生。而棕色脂肪组织具有非战栗产热的能力,棕色脂肪含有丰富的线粒体,并可表达解耦联蛋白 1(uncoupling protein 1,UCP1),通过 UCP1使线粒体的氧化磷酸化解偶联,氧化分解脂肪,减少脂肪堆积。Irisin 可增加白色脂肪组织 UCP1 的表达,使白色脂肪组织棕色化,增加脂肪组织生热作用以及能量消耗,具有减重和改善胰岛素抵抗的作用[6]。
在 T2DM 患者,血清 irisin 水平较健康人群低[8,9,19]。T2DM 患者血清 irisin 浓度与腰臀比、餐后 2h 血糖、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)呈负相关[20]。这表明增加人体内的 irisin 水平可能会降低血糖水平、改善胰岛素抵抗。目前关于 irisin与胰岛 β 细胞的功能之间的相关性存在争议,有研究发现,irisin 水平与胰岛素抵抗指数呈正相关,但是与胰岛 β 细胞功能之间没有相关性[21],也研究表明,在正常糖耐量人群中,血清 irisin 水平与 β 细胞功能指数 HOMA-β 密切相关[11]。关于 irisin 与胰岛 β 细胞功能之间的关系还需进一步研究。
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4 结 论
本部分研究探讨了 irisin 对高糖诱导的 INS-1 细胞凋亡的影响以及相关机制。研究结果证实 irisin 可以抑制高糖环境下 INS-1 细胞的凋亡,并且可以改善高糖处理后的 INS-1 细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能。Irisin 发挥抗凋亡的作用与增加抗凋亡蛋白以及抑制促凋亡蛋白的水平有关。Irisin对胰岛 β细胞的保护作用为其在T2DM的治疗中提供了新的理论依据。
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参考文献(略)
 
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