水通道蛋白 1 在长期高糖腹膜透析液诱导的小鼠腹膜纤维化中的作用

时间:2017-04-06 21:11来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者使用HE、Masson、免疫组化染色及透射电镜扫描等方法对比观察由腹膜透析引起的腹膜纤维化过程中AQP1对腹膜间皮细胞的影响。
第 1 章 引 言
 
腹膜透析因其价格低廉、操作方便、血液动力学稳定、中分子清除率以及残存肾功能的保护优于血液透析,有大约 15%的终末期肾衰竭患者选择腹膜透析,但随着透析时间的延长,因超滤衰竭(ultrafiltration failure,UFF)而退出腹膜透析的发生率也逐年增加,据统计,腹膜透析患者第 1 年 UFF 发生率为<3%,第 3 年为 9.5%,4 年以上为 36%[1]。因此,如何延长腹膜透析的时间,为学者们研究的热点问题。超滤衰竭指使用 4.25%葡萄糖腹膜透析液在腹内留存 4 小时后,超滤量小于400ml,但需排除患者因素、医生因素、机械因素等非治疗本身引起的问题。超滤衰竭的病理基础为腹膜纤维化[2],而腹膜上皮-间皮细胞转分化被普遍认为是腹膜纤维化的病理基础,也是腹膜纤维化的起始和可逆环节[3]。腹膜上皮间皮细胞转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)指有极性的上皮细胞在多种因素刺激下转换成有活动能力、能在细胞基质间自由移动的间充质细胞的过程。此现象由 Yá ez-MóM 等于 2003 年首次提出[4],即上皮细胞表达的上皮细胞标志物下降,而新表达成纤维细胞标志物,并且转分化的细胞穿过基底膜移行至间质参与纤维化的形成[5-7]。因此了解 EMT 的始动、促进及逆转因素是防治腹膜纤维化的关键。
水通道蛋白 1(aquaporin1, AQP1)是水通道家族的成员之一,是细胞膜上转运水的特异性通道蛋白,由 Arge 等首次发现。在人体内分布十分广泛,在毛细血管内皮细胞,肾小管细胞,红细胞膜,以及晶状体等均有表达,而腹膜间皮细胞也被证明有水通道蛋白 1 的表达。在腹膜透析中 AQP1 在水的弥散和超滤方面扮演着重要的角色,它表达于腹膜小静脉和毛细血管的内皮,是腹膜三孔模型中的超小孔,只促进水的转运而不转运溶质。在高渗状态下,AQP1 介导 50%的超滤[8],因此有学者提出 AQP1 的功能不足可能也是超滤失败的一个原因。有关纤维化和 AQP1 的关系目前报道很少,有学者发现伴有广泛胆管增生、纤维化的 Ezrin 敲除小鼠的胆囊上皮细胞 AQP1 表达减少[9],还有学者发现在辐射介导的伴有纤维化的肺毒性损伤中,毛细血管内皮的 AQP1 表达下降[10]。这些证据表明 AQP1 参与了体内多种疾病的纤维化进程,但在腹膜透析引起的腹膜纤维化过程中 AQP1 的作用仍不清楚。
此外,AQP1 可能不仅仅是一种水通道,Verman 在研究肿瘤血管生成不良的原因时发现 AQP1 可以促进内皮细胞的移行[11],并提出可能的机制是 AQP1 可以通过水的跨细胞转运而极化移行细胞的边缘,而 AQP1 敲除鼠则发现其lamellipodial 肌动蛋白动力下降[12]。近年也有研究表明 AQP1 是细胞膜的支架蛋白,与多蛋白复合体有关,对细胞骨架的建立、细胞粘附和移动均非常重要[13],并提出 AQP1 通过 Lin7/b-catenin 蛋白影响细胞骨架的结构,从而促进细胞的移行[14]。而 AQP1 基因敲除的小鼠其创伤修复和细胞移行的功能均较未敲除小鼠有缺陷[15]。但在腹膜透析引起的腹膜的纤维化过程中,AQP1 是否参与腹膜间皮细胞 EMT 的过程,目前尚无这方面的研究。本实验利用 AQP1 基因敲除小鼠,通过手术插管的方式建立小鼠慢性腹膜透析腹膜纤维化模型,并给予 4.25%葡萄糖腹膜透析液腹膜透析。使用 HE、Masson、免疫组化染色及透射电镜扫描等方法对比观察由腹膜透析引起的腹膜纤维化过程中AQP1对腹膜间皮细胞的影响,同时利用该基因敲除鼠建立1型糖尿病模型,对比观察内源性血糖增高的情况下 AQP1 对腹膜间皮细胞的作用,进一步验证AQP1 对腹膜间皮细胞的保护作用。从而为延缓腹膜纤维化,延长腹膜透析时间提供新的理论依据及治疗思路。
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第 2 章 文献综述
 
2.1 慢性肾脏病概述
2.1.1 慢性肾脏病的病因
在我国,2006 年北京市117 家医院共 121 个透析中心登记数据显示透析患者常见的原发病病因依次是慢性肾炎、高血压、糖尿病肾病以及慢性间质性肾炎和其它肾脏病[19]。表明慢性肾炎、高血压及糖尿病这三种疾病在我国也是 CKD 的主要病因。CKD 的易患因素主要有年龄(如老年)、终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)家族史或遗传性肾脏疾病、糖尿病、高血压、心血管疾病、肥胖-代谢综合征、高蛋白饮食、高血脂症、高尿酸血症、伴有潜在肾损伤的多系统疾病例如系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、泌尿系感染或全身感染、肝炎病毒(如乙型或型肝炎病毒)感染、泌尿系结石、尿道梗阻、泌尿系或全身肿瘤、应用肾毒性药物史、贫血、吸烟、出生时低体重等。其他危险因素还包括环境污染、经济水平低、医保水平低、教育水平低等,都应引起人们的重视。
2.1.2 慢性肾脏病的分期
目前普遍使用美国肾脏病基金会专家组对 CKD 提出的新的分期方法[表 2.1]。由于肾小球滤过率相对于其它肾功能的评价指标如肌酐、尿素氮等更为有效而可靠,故使用肾小球滤过率作为评价肾功能和分级的标准,而使用这一标准的原因在于对早期肾脏病患者的管理、干预及治疗指导,从而延缓其肾脏病的进展,保护各脏器的功能,减少并发症的发生[18]。
2.1.3 慢性肾脏病的治疗
CKD 治疗的目的是减缓或阻止 CKD 的进展。美国肾脏病基金会根据疾病分期制定了不同的治疗方案。对于第 1 期 CKD 患者重点是去除易感因素治疗原发病,如戒烟、控制体重、降血脂、控制血压等。第 2 期 CKD 患者以降低心血管疾病风险治疗为主,如使用血管紧张素转换酶抑制剂或使用血管紧张素 II 受体拮抗剂,同时还具有减缓肾功能进展的作用[20]。第 3 期及第 4 期 CKD 患者以评估和治疗并发症为主。当 CKD 患者疾病进展至终末期肾病即慢性肾脏病第 5 期时,应积极行肾脏替代治疗,包括血液透析、腹膜透析和肾移植治疗。
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2.2 腹膜透析疗法及研究进展
两种数学模型被用来描述物质跨腹膜转运的过程。一种为三孔模型,可以比喻为分子筛,即各种分子包括蛋白质、电解质以及水分子依据孔径大小经过腹膜。这三种孔径分别是超小孔、小孔和大孔。超小孔的本质为水通道蛋白 1,仅供水分子通过,小孔为上皮细胞间隙,水分及小分子溶质可以通过,而大孔解剖基础为细胞间裂隙,大分子溶质及蛋白质通过大孔实现跨膜转运。经过数学计算可以定量的分析水及溶质的跨膜转运过程,故而已在临床上广为应用。另一种模型为分布模型,重点描述溶质从毛细血管扩散到组织间液,组织间液内溶质的扩散,最后由组织间液扩散到透析液的过程。分布模型能较为准确的分析小分子溶质及水分子随时间变化转运的过程。但是无论哪种模型均未引入个体化特征参数[26,27]。
腹膜炎是腹膜透析中最常见的并发症,它可以由肠道因素(胃肠菌群感染)或非肠道因素(接触、医源性感染等)引起[28]。巴西东北部一项针对 90 名在家进行腹膜透析治疗患者的定量、横断面研究显示 2 年以上的腹膜透析患者腹膜炎的发生率更高,而腹膜透析导管出口感染的发生率与腹膜透析治疗时间长短呈正相关[29]。还有研究表明 PD 患者使用胃酸抑制剂可以增加肠道因素引起腹膜炎的风险,并建议尽量选用质子泵抑制剂[30]。包裹性腹膜硬化 (encapsulatingperitoneal sclerosis, EPS) 因为其在腹腔内肠管外可以形成厚厚的纤维层而引起肠道梗阻,因此是腹膜透析最严重的并发症,虽然有报道认为腹膜透析患者中EPS 的发生率在 0.5% - 4.4%之间,但是它引起的死亡率在却达到 20% - 93%[31,32]。其发生机制目前仍不十分清楚,但长期腹膜透析、醋酸盐缓冲液、高渗溶液、反复发作的腹膜炎,尤其是由金葡菌、真菌及假单胞菌感染引起的腹膜炎都被认为与 EPS 密切相关[31]。脂质代谢异常也是腹膜透析患者常见的并发症,它可以增加患者心血管事件的发生率,以甘油三脂、低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白增高,而高密度脂蛋白降低为特点。一项6个月251位接受腹膜透析糖尿病患者的前瞻、开放、平行组、多国、随机对照试验结果显示使用传统的葡萄糖透析液治疗方案相比,低血糖-透析液方案能显著改善 PD 患者动脉粥样硬化脂蛋白表型[33]。表明葡萄糖作为腹膜透析液的渗透剂,有助于这种异常脂蛋白血症的发生。此外,透析过程中液体丢失过多会导致低血压甚至低血容量性休克的发生,而过多的液体潴留可引起高血压和水肿的发生。腹膜透析液 PH 值、温度以及液体进出量的速度以及导管的位置与透析过程中腹痛的发生有关。其它如出血、营养不良、离子紊乱等也是腹膜透析中比较常见的并发症。
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第 3 章 小鼠腹膜透析腹膜纤维化动物模型建立..............................17
3.1 实验材料 ..........................................................17
3.1.1 实验动物 .......................................................17
第 4 章 水通道蛋白 1 在长期腹膜透析腹膜纤维化过程中对腹膜的保护作用 ..........33
4.1 实验材料 ..........................................................33
4.1.1 实验动物分组及标本留取 .....................................33
第 5 章 高血糖条件下 AQP1 对腹膜间皮细胞的影响...........49
5.1 实验材料 ...........................................49
5.1.1 实验动物分组及标本留取 .........................49
 
第 5 章 体内高血糖环境下 AQP1 对腹膜间皮细胞的影响
 
5.1 实验材料
5.1.1 实验动物分组及标本留取
前述具有 CD1 遗传背景的 10 只 AQP1 小鼠(雌性)及 10 只 AQP1 敲除小鼠(雌性)分成 4 组,每组 5 只。分别是对照组,糖尿病组,AQP1 敲除组和AQP1 敲除糖尿病组。糖尿病组小鼠建立 1 型糖尿病模型,4 个月后人性化处死小鼠,留取腹壁组织置于 10%福尔马林溶液中保存用作 HE 染色。
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5.2 实验方法
5.2.1 1 型糖尿病模型建立
分别测量小鼠的体重、血糖作为基线,取血糖正常的健康小鼠作为实验用鼠。糖尿病组小鼠应用 STZ 诱发 1 型糖尿病,其中 STZ 溶解在 0.1 M、pH4.5 的柠檬酸钠缓冲液中(缓冲液配制:柠檬酸 0.4418g、柠檬酸钠 0.7938g 溶于 100ml 蒸馏水中,过滤除菌)。按 50mg/kg 体重单次性腹腔注射,注射后第 3 天开始从小鼠尾静脉中采取静脉血,检测空腹血糖,连续 5 天,血糖水平≥16.7mmol/l 定义为糖尿病,模型建立后 4 个月人性化处死各组小鼠,如前述取腹膜标本。
使用HE染色及马松染色观察腹膜结构、细胞形态及腹膜纤维化程度。结果显示对照组、AQP1敲除组、糖尿病组、AQP1敲除糖尿病组的小鼠腹膜无明显增厚,未见大量纤维结缔组织。对照组、AQP1组、糖尿病组的腹膜间皮细胞亦无明显异常改变,呈扁平梭形贴附于腹壁肌层,而AQP1糖尿病组的小鼠腹膜间皮细胞出现轻微改变,可见细胞核密集,呈圆形或椭圆形,测量各组细胞核的最短经,结果显示较其它三组明显增大,p<0.05, 细胞形态也从梭形变成矮柱形。
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结 论
 
1. 成功建立了由腹腔导管注入腹膜透析液的腹膜透析腹膜纤维化的小鼠模型。给予腹膜透析液后腹膜明显增厚,差异具有显著性。
2. 证实了 CD1 遗传背景的 AQP1 小鼠腹膜间皮细胞有 AQP1 的表达,且小鼠的腹膜仅为单层上皮细胞及少量纤维结缔组织及毛细血管构成,非独立性的结构。
3. 本实验从电镜水平上未发现腹膜上皮-间皮细胞转分化移行的证据。
4. 长期高糖环境可以通过局部高渗的作用引起腹膜间皮细胞的损伤,而AQP1 缺失会加重这种损伤。
5. 长期使用高浓度葡萄糖腹膜透析液进行腹膜透析对血糖无明显影响。
课题创新性总结
1. 建立了小鼠腹膜插管透析腹膜纤维化的动物模型。
2. 本实验首次讨论了 AQP1 与腹膜纤维化的关系,在长期高糖腹膜透析液引起纤维化的过程中,AQP1 缺失会加重这种损伤。
3. 本实验首次通过超微结构的观察探讨了纤维化的腹膜中成纤维细胞的起源,在电镜水平上未发现腹膜上皮-间皮细胞转分化的证据。
4. 本实验首次报道了纤维化的腹膜中 AQP1 在不同位置上表达的变化,在腹膜表层的间皮细胞,AQP1 较未透析组表达下降,而在纤维化的腹膜中出现大量毛细血管样的 AQP1 的表达。
5. 本实验首次观察了 AQP1 在小鼠 1 型糖尿病模型中对腹膜间皮细胞的影响。
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参考文献(略)
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