IL-24 对 HUVEC 氧化应激损伤的保护机制研究及其与高血压疾病的相关性

时间:2017-04-05 19:44来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者分别从造模成功和降压治疗后两个阶段,检测 IL-24 蛋白和 RNA 与高血压疾病的血压变化进展以及治疗的相关性,从而分析降压药物依那普利和硝苯地平发挥降压作用
前 言
 
近年来,心血管疾病不良事件发生不断增多,已经超过癌症成为西方国家的首位死因[1, 2]。高血压作为老龄化社会的突出疾病,是一种常见的慢性病,可引起多种心脑血管危险事件,如心肌梗死、心力衰竭、脑血管意外等[3]。高血压各种复杂的病理生理机制有一个共同点就是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的利用度增加,即氧化应激。ROS 参与多个心血管疾病的病理发生发展过程,如高血压。在体循环中,活性氧可以由血管平滑肌细胞(VSMCs)、血管内皮细胞(VECs)及成纤维细胞等多种细胞产生。活性氧在心血管系统中调控血管内皮功能,参与血管内皮炎症、增殖、迁移、凋亡、血管生成等过程。活性氧产生增强,以及抗氧化系统作用功能的减弱,结果可导致血管内皮损伤和功能异常,这是导致与血管内皮作用关系密切的,如高血压、动脉粥样硬化等疾病的重要原因。过量产生的 ROS 可导致一氧化氮的生物利用度被削弱,从而引起血管内皮的功能异常,发生血管的舒张功能受损,故自由基清除剂可以改善或提高受损血管的舒张功能,并能发挥降低血压的作用。对于血管内皮细胞损伤的治疗和修复保护,目前有学者将其视为降压治疗的终点,和疾病发展转归的危险预测信号[4],,所以,研究血管内皮细胞的损伤与保护对于疾病预测和治疗观察意义重大。
既往血管内皮仅被视为隔离血液与管外组织的屏障,随着血管因子的发现,血管内皮的功能逐渐得到认识。目前发现血管内皮功能主要包括下述几个方面:具有正常功能的血管内皮可以通过调节下列平衡来维持血管张力和结构稳定:血管舒张功能和收缩作用间的平衡,生长促进和抑制的平衡,血栓形成促使和抑制的平衡,炎症对抗和促进间的平衡,以及氧化作用促进和削弱之间的平衡[5-8]。内皮功能障碍可能是导致高血压等心血管疾病领域疾病发病机制中的初始步骤,研究指出在有效的降压治疗后,血管内皮的舒张功能也可恢复正常[4],这提示高血压病理过程可以导致 VECs 功能异常,而不能仅仅认为 VECs 的损伤和功能不全导致高血压的发生。总之,VECs的功能完整与否与高血压的发病机理以及治疗与转归互为因果。心血管疾病和癌症是目前发达国家两大导致人口死亡的主要原因,这两种慢性疾病似乎是多阶段的进展病程,与遗传,营养,心理,社会-环境和病毒因素等都有着密切的联系。引起这两种疾病有关的共同的分子机制——氧化应激和细胞损伤[9]。动脉粥样硬化的发病可能源于损伤、感染所致的变异或转换单一的动脉平滑肌细胞的祖增殖克隆,类似于目前最广泛持有的致癌发生理论。考虑到二者共同的发病机制,一些新型的治疗策略可以同时针对这些分子机制,即针对心血管疾病和癌症的共同发病分子机制有着类似的治疗策略,主要包括以下几个方面[10]:1)减少吸烟、减少膳食脂肪摄入和给予抗氧化剂治疗来减弱氧化应激带来的损伤;2)使用抗炎剂,以减少趋化因子,细胞活素和生长因子的细胞信号;3)采用抗增殖药物靶向针对生长因子受体来抑制细胞增殖;4)减少过量的蛋白酶基质消化;5)降低蛋白酶体抑制剂相关NF-κB 信号通路;6)使用抗血管生成策略延缓动脉硬化和癌症斑块扩张浸润转移;7)使用放射治疗(未经证实)预防血管成形术和支架置入术后再狭窄,同样放射治疗也是肿瘤主要治疗方法之一。
IL-24 作为近年来新发现的抑癌基因,能够针对性的作用于肿瘤细胞而不损伤正常细胞,并且可以发挥免疫调节作用。它是目前研究唯一发现的既能抗肿瘤,又能发挥免疫调节功能的细胞活素。它发挥治疗作用主要通过下述几个机制:促进肿瘤细胞发生凋亡,从而抑制瘤体的生长和转移[11, 12];IL-24 体内具有抗血管生成作用[13, 14],抑制肿瘤血管形成和淋巴管转移[15];调节肿瘤组织中各种与浸润侵袭关系密切的生长因子产生,如基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、PI3K/PKB 信号通路等,从而抑制细胞生长和扩散[16, 17];提高放疗敏感性以提高放疗的疗效[18]。在此研究基础上,我们不难发现,对于心血管疾病和肿瘤的共同治疗策略,IL-24可以在多个方面起到治疗作用,例如:减弱氧化应激,抑制血管生成,减少炎性细胞因子生成,抑制细胞生长和转移信号通路,增加细胞对放射线的敏感性。
高血压是一种多基因慢性疾病,是基因结构和表达异常的结果,已有研究发现机体有上百种易感基因与高血压疾病发病有关,如血管紧张素原基因(AGT),α-骨架蛋白基因(ADD)等,这些基因在不同种族和人群中具有不同的多态性,不仅与高血压疾病发病有关,还与治疗密切相关。最近又有研究通过基因微阵列分析表明,抗高血压药物可以导致 16 种既往在心血管疾病中没有发现的基因的差异表达,其中包括 IL-24 基因。综上,本课题的研究目的为,探讨 IL-24 是否对氧化应激导致的血管内皮损伤具有保护作用,从而参与心血管疾病的分子机制治疗策略,以及 IL-24 基因是否为降压药物作用于心血管系统的治疗靶点。体外实验部分,通过外源性导入基因重组质粒pDC-316-IL-24 至体外培养脐静脉内皮细胞,研究目的基因表达是否对氧化应激导致的血管内皮损伤能产生抗氧化保护及可能的作用机制;动物实验部分,利用血管紧张素 II(AngII)皮下植入微量渗透泵构建大鼠高血压模型,分别从造模成功和降压治疗后两个阶段,检测 IL-24 蛋白和 RNA 与高血压疾病的血压变化进展以及治疗的相关性,从而分析降压药物依那普利和硝苯地平发挥降压作用的分子机制,初步探讨IL-24 基因是否为高血压等心血管疾病的药物治疗靶点和可能分子通路的关键基因。
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第一部分 IL-24 基因对过氧化氢导致 HUVEC 氧化损伤的保护作用和机制研究
 
前 言
高血压疾病是一组多因素相关引起的疾病,是由于家族遗传因素、生理状态、生活习惯及工作环境共同影响导致的病理状态。在 2005 年进行的关于中国人口主要死因的队列研究发现,癌症、心血管和脑血管疾病是中国人口的主要死因,其中,高血压是导致人口高死亡率重要的可控危险因素[19]。高血压作为导致心血管疾病死亡率的重要因素,可以通过多种机制导致终末目标组织器官如心脏、脑、肾、肝脏、肾脏和血管的损伤[20, 21]。已有很多报道高血压可以导致心脏和脑组织损伤,可能引起心肌肥大和中风等危险事件发生[22]。
高血压的发病原因和病理生理机制在近年来经过了广泛而详细的深度研究,但其明确的发病原因仍不清楚,并且其病理生理机制十分复杂,涉及到了机体众多机制的改变,例如 G 蛋白偶联受体信号通路,肾素血管紧张素醛固酮系统,血管内皮损伤及血管炎症反应等,在这些复杂的病理生理机制有个共同的始动因素——氧化应激。有证据表明,氧化应激参与许多疾病的发病机制,包括高血压,高胆固醇血症,动脉粥样硬化,糖尿病,心脏衰竭。已有很多研究已经证实,多种高血压造模动物中均可以发现氧化应激的增加,在原发性高血压,先兆子痫,肾心血管性高血压等疾病中都可以发现 ROS 明显升高[23]。
对于血管内皮的认识,已经从多年前的单纯性渗透屏障,转变为不仅仅是一层选择性渗透膜,而是一个调节血管张力和结构基础的自我平衡器官。血管内皮参与正常血管张力的维持和适应性调节,以及有效调控机体血小板聚集以维持正常凝血功能[25]。心血管疾病高危因素如老龄化、绝经、吸烟等都可以导致血管内皮功能恶化,而血管内功能障碍则会增加高血压和糖尿病的易感性[26]。虽然导致血管内皮功能障碍具有多种复杂的机制,但越来越多的证据表明,ROS 产生过多可以直接导致血管内皮功能障碍[27]。氧化应激导致的血管内皮功能受损,在动物模型中已被证实与很多疾病有关,包括高血压、心衰等[28-30]。血管内皮功能障碍是被用来指一些病理情况,包括抗凝血功能的改变,内皮细胞的抗炎特性,血管生长调节受损以及血管重塑失调[31]。冠状动脉循环中异常的血管舒张功能,与血管内皮关系密切,对于预测不良心血管事件和远期结果具有重要的意义[32]。前列环素和一氧化氮等多种血管扩张剂,以及包括如血管紧张素和血栓素等血管收缩因子,都是从 VECs 释放的[5, 33, 34]。
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第一节 IL-24 基因对低浓度 H2O2致 HUVECs 增殖的作用研究
1 材 料
1.1 主要试剂和细胞
DMEM 培养基:Gibco 公司,美国
胰蛋白酶-EDTA:北京索宝来公司
胎牛血清:浙江天杭生物
青链霉素混合液:北京索宝来公司
质粒 pDC316-hIL-24:北京本元正阳
空质粒 pDC316:北京本元正阳基因
质粒抽提试剂盒:杭州博日
Lipofectamine 2000:Invitrogen 公司,美国
二硝基亚砜:郑州益康化工产品有限公司
LB 培养基:北京诺博莱
PBS 缓冲液:博士德生物
引物:上海生工
RNA 抽提试剂盒:Omega 公司
EDTA:solarbio 公司,西班牙
SDS、甘氨酸:北京索宝来公司
TEMED:Sigma 公司,美国
SDS-PAGE 上样缓冲液:北京康为世纪
逆转录试剂盒:Fermentas 公司
过硫酸铵:Sigma,美国
人脐静脉内皮细胞(HUVEC):中科院上海生物研究所

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第一部分 IL-24 基因对过氧化氢导致 HUVEC 氧化损伤的保护作用和机制研究......4
前 言.......................................................................4
第一节 IL-24 基因对低浓度 H2O2致 HUVECs 增殖的作用研究.......................8
1 材 料 ................................................................. 8
第二部分 IL-24 与高血压疾病发病和治疗相关性的研究..........................5
1前 言......................................................................5
1第一节 高血压大鼠模型建立与 IL-24 基因表达的相关性研究..............52
1 动物和材料 ............................................................ 52
 
第二部分 IL-24 与高血压疾病发病和治疗相关性的研究
 
前 言
前期有研究报导抗高血压药物可以导致肾脏和膀胱组织的基因表达的改变[38, 39]。最近又有研究表明,抗高血压药物可以导致心脏、脑和肝脏组织基因表达改变,发现既往报道过的与心血管疾病有关的 33 种基因的改变,另外还采用基因微阵列分析发现了 16 种既往在心血管疾病中没有发现的基因的差异表达,其中包括白介素 24(IL-24)基因,组织蛋白酶 Z (Cathepsin Z, Ctsz)基因,分泌型载体膜蛋白(Secretorycarrier membrane protein 2 ,Scamp2)基因等。差异表达的基因可能是潜在的生物标志物以及对预防心血管疾病的新靶点,可能为抗高血压药物的发展提供有价值的信息。最近有研究发现,一系列的分子标志物和基因通路共同参与心血管疾病和癌症的疾病发生和发展过程[43, 97],针对这些共同的发病分子机制,研究者们提出了一些新型的治疗策略可以同时针对心血管疾病和癌症,和浸润性病变,即针对心血管疾病和癌症的共同发病分子机制有着类似的治疗策略[10]。
IL-24 基因生物学功能不仅限于肿瘤领域,又类似于细胞活素具有免疫调节作用,其生物学作用范围涉及到上述心血管疾病和癌症新型治疗策略的多个方面,包括诱导异常细胞凋亡、减弱氧化应激、抑制血管新生、增加细胞对放射线敏感性等多个方面,所以我们推测 IL-24 可能跟高血压病理进展存在密切联系,同时发挥潜在生物学治疗价值。结合前期的关于高血压和基因谱表达改变的关系,以及 IL-24 基因在心血管疾病方面的一些研究结论,我们利用血管紧张素 II 微量渗透泵构建大鼠高血压模型,分别从造模成功和降压治疗后两个阶段,检测 IL-24 蛋白和 RNA 与高血压疾病的发生发展以及治疗的关系,从而分析降压药物依那普利和硝苯地平发挥降压作用的分子机制,初步探讨 IL-24 基因是否为高血压等心血管疾病的药物治疗靶点和可能分子通路的关键基因。
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讨 论
高血压在脑血管意外、外周动脉疾病、慢性肾病等病理过程中都起着重要作用。高血压作为已知危险因素可以通过各种机制损伤终末器官如心脏、肝、脑组织、肾、血管等组织器官,并成为致高死亡率的主要原因[20, 21]。已有研究报道指出,高血压可以损伤心脏和脑组织,导致心肌肥大和中风[100]。目前,降压药用于临床的包括利尿剂,ACE 抑制剂,钙通道阻滞剂,β-受体阻滞剂,以及 AngII 受体拮抗剂[101]。依那普利作为一种 ACE 抑制剂,通过降低 AngⅡ血浆水平从而降低血压[102]。还有研究发现依那普利可以减少颈动脉内膜和中间层的增厚,减少高血压和糖尿病人的血管收缩和醛固酮分泌[103]。硝苯地平作为一个 L 型钙通道阻滞剂,能抑制钙离子跨膜内流[104]。硝苯地平效应致动脉血管扩张,减少活性氧(ROS)产生和 VSMCs 增殖[105]。然而,这两种常用药物调节血压的靶分子仍有待确定。
为了确定参与心血管疾病,尤其是高血压疾病的基因,有学者用基因微阵列分析,检测高血压病人大脑和肝脏的基因表达谱,并尝试明确在构建成功的高血压动物模型中,依那普利和硝苯地平治疗所作用的目标基因。他们研究发现经这两种抗高血压药物作用后可以引起 33 种与心血管疾病发生有关的基因表达的改变,这些基因既往在多个课题研究中证实明确参与心血管内科疾病,除此之外,还发现了既往未曾在心血管疾病中未曾有过报道的与心血管疾病发病机理相关的 16 种基因的表达改变,包括Mef2d, IL-24, occludin, Pparδ, triadin, 溶酶体半胱氨酸蛋白酶基因等。这些基因有的曾在心血管疾病研究中发现有过作用,但未曾有报道在降压药物治疗后可引起其表达的改变。其中 IL-24 作为上述研究列出的一个基因,它在心血管领域的作用既往未曾进行广泛研究和关注。
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参考文献(略)
 
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