自噬调控在RBM5抑制肺腺癌细胞增殖及逆转化疗耐药中作用的研究

时间:2017-04-01 21:20来源:www.020lunwen.com 作者:feifei 点击:
本论文是医学硕士论文,笔者认为自噬是一种进化保守的、对于维持细胞内环境稳定具有重要作用的生物学过程。自噬的异常与肺癌的发生相关。
第 1 章 引言
 
肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一,其中肺癌位居世界肿瘤死因的首位[1]。《2012 中国肿瘤登记年报》显示肺癌居我国恶性肿瘤发病率和病死率首位,每年有 70 余万人罹患肺癌,有 60 余万人死于肺癌。其中约 85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),尽管近年来 NSCLC 的诊断和治疗逐渐发展,新的诊断方法不断被采用,手术方案不断革新、化疗方案及新的化疗药物不断改进及新的治疗方案(如分子靶向治疗等)不断应用于临床,但是其 5年生存率仍较低,不足 17%[2,3]。化疗仍是晚期 NSCLC 的一线标准抗肿瘤治疗方案之一,其中以顺铂为基础的联合化疗是包括肺癌在内的多种肿瘤的一线化疗方案。尽管含顺铂的联合化疗在临床上能够改善患者的生存情况,但是由于顺铂耐药的发生严重影响了其临床疗效和患者远期预后。因此深入理解顺铂耐药机制并克服顺铂耐药、找寻新的抗肿瘤方案,是临床亟待解决的问题,也是目前国内外学者研究的热点问题之一。
在过去的 40 年时间里,人们已经发现了一系列的顺铂耐药机制[4]:例如 DNA 结合不充分、细胞解毒能力增强、DNA 损伤修复能力增强、细胞转运能力增强以及细胞死亡通路相关蛋白激活和表达改变等等[5]。近年来,越来越多的研究表明自噬在肿瘤对放化疗耐受中起到了重要的作用。自噬是一种在所有真核细胞中存在的进化保守的生物学行为,参与到与溶酶体降解细胞内组分的过程中,这些组分包括胞浆成分、过剩的蛋白、损坏的细胞器及细胞内微生物等。在自噬过程中,细胞浆内物质被隔绝在双层膜结构的囊泡中,这种囊泡叫自噬体。然后自噬体与溶酶体融合,囊泡内物质被溶酶体降解并释放出合1成大分子物质的原料和能量。自噬的一个重要生物学功能就是除去过剩的和损坏的细胞器以适应不断变化的营养状态及保持细胞内环境稳态[6,7]。自噬调节异常与多种疾病相关,其中就包括肿瘤[8]。但是在肿瘤的不同阶段,自噬所起的作用是不同的。在早期肿瘤发生时,自噬是一种肿瘤抑制因子,自噬的下调与肿瘤发生相关;而在已形成的肿瘤中,自噬起到保护细胞克服营养不足及基因损伤等不利环境影响,维持细胞生存[9],然而在极端不利条件下,自噬也会促进程序化细胞死亡。因此自噬在肿瘤发生及细胞对抗肿瘤药物敏感性方面所起的作用仍未完全明确。近年来研究表明自噬在肺癌细胞顺铂耐药过程中起到一定作用[10,11],但是顺铂耐药过程中自噬的调控机制仍不明确。
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1.2 综述 2:自噬与肺癌的研究进展
自噬是一种最主要的细胞内降解系统,通过它细胞内物质被运送到溶酶体降解。但是自噬的功能不仅仅是简单的清除物质及材料,而是起到一种循环利用的作用,为细胞提供新的合成反应的原料和能量,从而促进细胞新陈代谢和维持内环境稳定。
越来越多的证据表明自噬在人类疾病发生发展中发挥复杂的作用:1)人们普遍认为自噬是先天性免疫及适应性免疫的关键调节因子,其机制与自噬调控炎症调节、抗原提呈、病原体清除过程有关,因此适当的自噬对于维持机体正常免疫功能具有重要作用,自噬改变可能会引起免疫相关疾病或炎症性疾病的发生[81];2)自噬在维持细胞内重要细胞器(如线粒体)数量方面有重要作用,他们具有维持细胞能量和内环境稳定功能[82,83]。近年来研究表明许多调节自噬的信号机制同时调节凋亡和坏死[84-87]。自噬、凋亡和坏死是 3 种最主要的程序化细胞死亡(programed cell death,PCD)机制[88-90],对于消除异常或损伤细胞(例如基因损伤的细胞)、维持机体健康有重要作用。人们发现自噬的调节异常(增高或减低)可能与多种疾病相关:例如感染或炎症性疾病、代谢性疾病、肿瘤、神经系统疾病等,累及多脏器系统,包括心脏、肾脏、肺脏、肝脏、神经系统等[91-94]。同时自噬也可以成为上述疾病治疗的靶点之一[92,95]。在此我们将集中讨论自噬的发生、调节及其与肺癌发生、发展、治疗之间关系的研究进展。
1.2.1 自噬的概述
所有的生命体均进行新陈代谢,人类的细胞和细胞内的细胞器也是一样,不停地进行重塑和循环再利用。真核细胞中有两种主要的降解途径:蛋白酶体和溶酶体途径。蛋白酶体途径是高选择性的蛋白降解途径,主要识别和降解泛素化的蛋白,主要是一些短寿命蛋白。而溶酶体途径并不具有选择性,细胞外的物质和膜蛋白可通过胞吞方式输送到溶酶体降解。不仅如此,细胞内组分和细胞器也能够被输送到溶酶体降解再利用,这一过程就叫做自噬[96]。
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第 2 章 材料和方法
 
2.1 自噬调控异常在人肺腺癌 A549 细胞顺铂耐药中的作用
2.1.1 主要仪器
电子天平:美国 OHAUS
全自动高压蒸气消毒器:日本 SONY
超净工作台:苏州净化设备厂 YZ-875CO2
细胞培养箱:日本 SANYO
倒置荧光显微镜:日本 OLYMPUS
酶标仪:美国 Bio-Rad
紫外分光光度计:日本岛津 Shimadazi
恒温水浴箱:江苏常州国华仪器厂
透射电镜:日本 HITACHI
低温高速离心机:日本 TOMY GRX-220
电泳仪:美国 Bio-radPCR 
扩增仪:美国 GeneAmp
凝胶成像系统:上海天能科技有限公司
切片机:德国 Leica
2.1.2 主要试剂
青链霉素合剂、顺铂、3-MA、MTT、吖啶橙、MDC 购自 Sigma公司。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶、购自 Gibco 公司,在 4℃条件下放置,配好长期不用-20℃冷藏。细胞培养板、培养瓶、培养皿等细胞培养耗材购自 Corning 公司。蛋白浓度检测试剂盒购自 Bio-Rad公司。PVDF 膜购自 Millipore 公司。蛋白裂解液购自上海碧云天公司。预染蛋白 Marker PageRuler Prestained Protein Ladder 10-170KD 购自Fermentas 公司。鼠抗人 RBM5 抗体购自 Santa-cruz 公司,鼠抗人LC3-A/B 抗体、兔抗人 Beclin1 抗体、鼠抗人β-actin 抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠多克隆抗体购自 Proteintech 公司,兔抗人 Lamp1 抗体购自 Abcam 公司。ECL 化学发光试剂购自 GE 公司。其它常规试剂购自上海生工生物工程有限公司。

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2.2 RBM5 过表达对人肺腺癌 A549 细胞自噬的调节作用
2.2.1 主要仪器
电子天平:美国 OHAUS
全自动高压蒸气消毒器:日本 SONY
超净工作台:苏州净化设备厂 YZ-875
CO2 细胞培养箱:日本 SANYO
倒置荧光显微镜:日本 OLYMPUS
酶标仪:美国 Bio-Rad
紫外分光光度计:日本岛津 Shimadazi
恒温水浴箱:江苏常州国华仪器厂
透射电镜:日本 HITACHI
低温高速离心机:日本 TOMY GRX-220
电泳仪:美国 Bio-radPCR 
扩增仪:美国 GeneAmp
凝胶成像系统:上海天能科技有限公司
切片机:德国 Leica
2.2.2 主要试剂
青链霉素合剂、顺铂、3-MA、MTT、吖啶橙、MDC 购自 Sigma公司。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶、购自 Gibco 公司,在 4℃条件下放置,配好长期不用-20℃冷藏。细胞培养板、培养瓶、培养皿等细胞培养耗材购自 Corning 公司。蛋白浓度检测试剂盒购自 Bio-Rad公司。PVDF 膜购自 Millipore 公司。蛋白裂解液购自上海碧云天公司。预染蛋白 Marker PageRuler Prestained Protein Ladder 10-170KD 购自Fermentas 公司。鼠抗人 RBM5 抗体购自 Santa-cruz 公司,鼠抗人LC3-A/B 抗体、兔抗人 Beclin1 抗体、鼠抗人β-actin 抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠多克隆抗体购自 Proteintech 公司,兔抗人 Lamp1 抗体购自 Abcam 公司。ECL 化学发光试剂购自 GE 公司。其它常规试剂购自上海生工生物工程有限公司。
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第 3 章 实验结果..................................................47
3.1 自噬调控异常在人肺腺癌 A549 细胞顺铂耐药中的作用 ......47
3.1.1 A549 及 A549/DDP 细胞顺铂敏感性检测 ........................47
第 4 章 讨论...................................................69
第 5 章 结论...............................................77
 
第 4 章 讨论
 
肺癌位居世界肿瘤死因之首[1],并且由于吸烟、大气污染等因素影响,其发病率有逐年上升趋势,是严重危害我国人民和全世界人类健康的重大疾病之一。《2012 中国肿瘤登记年报》显示每年有 70 余万人罹患肺癌,并有 60 余万人死于肺癌。NSCLC 占肺癌的 80%左右。尽管近年来经过人们的共同努力,NSCLC 的诊断和治疗得到迅速发展,诊断方法、手术方案、化疗药物及化疗方案不断革新,新的治疗方案(如分子靶向治疗等)不断应用于临床,但是其 5 年存活率仍不足 17%[2,3]。由于其起病隐袭、临床症状不明显,发现时多为晚期,已失去手术时机,因此化疗,尤其是顺铂为基础的双药联合化疗仍是大多数晚期 NSCLC 的基础治疗方案之一,可以改善患者生存状态,延长生存时间,改善患者预后[192],但是耐药的发生严重影响了其临床疗效和患者远期预后[193],有些患者表现为初始耐药,更多患者是初始治疗有效,但治疗过程中出现获得性耐药。因此明确顺铂耐药的分子机制对于改善其临床疗效具有重要作用。
我们以 A549 及应用顺铂大剂量冲击联合浓度递增诱导顺铂获得性耐药的 A549/DDP 为研究对象。首先我们证实了 A549/DDP 细胞对顺铂敏感性明显低于亲代 A549 细胞,A549/DDP 细胞耐药指数>8,IC50值为>256μg/ml,提示 A549/DDP 细胞对顺铂高度耐药。我们的体外实验再次验证了应用顺铂作用于人肺腺癌细胞可以诱导获得性顺铂耐药,而且其耐药性可以在顺铂持续作用的情况下得到维持,再次验证了顺铂获得性耐药的存在和真实性。而 A549/DDP 细胞体积增大,大小不一,出现巨细胞,细胞形态改变提示肿瘤细胞在顺铂诱导获得性耐药过程中出现表观遗传学变化,出现多种基因或通路的激活/灭活,并引起细胞某些生物学功能的变化,例如凋亡抑制、自噬激活等等。
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第 5 章 结论
 
自噬是一种细胞“自食(Self-eating)"现象,其生物学功能是在真核细胞内依赖于溶酶体降解蛋白和细胞器,从而为细胞提供能量、合成大分子物质及细胞器的原料,从而在复杂的环境中维持细胞内环境稳定[6,7]。自噬在肿瘤细胞的发生、发展及肿瘤治疗中发挥着复杂的作用,是一把双刃剑。首先,作为一个重要的细胞防御机制,自噬可以通过保护线粒体、清除细胞内废弃蛋白及细胞器、循环利用代谢产物、灭活炎症因子抑制炎症反应来维持基因和细胞稳定性,从而在早期肿瘤发生过程中起到抗肿瘤作用[202],但是在已经形成的肿瘤细胞中,自噬可以在各种不利的生长条件下维持细胞生存、促进化疗耐药并促进肿瘤进展。在肿瘤治疗过程中,自噬所起到的作用也是具有两面性,一方面适应性自噬使肿瘤在抗肿瘤治疗的毒性条件下继续生存及生长;但是,在一定条件下,自噬可以介导部分抗肿瘤药的作用,引起的细胞死亡,即“自噬性细胞死亡(autophagy cell death)”,也被称为 II 型程序性细胞死亡。
为了进一步验证自噬在顺铂获得性耐药过程中所发挥的作用,我们通过 Western blot 检测、吖啶橙染色、MDC 染色、透射电子显微镜检测这四种方法检测顺铂耐药的 A549/DDP 细胞及其亲代 A549 细胞的自噬活性。首先应用 Western blot 检测了自噬相关蛋白 LC3-II、Beclin1 及 Lamp1 的蛋白表达水平。LC3-II 定位于前自噬体和自噬体,是形成包裹破损的细胞器的双层膜结构的主要成分,因此 LC3-II 是自噬体的特异性蛋白标志物,LC3-II 的量及 LC3-II/LC3-I 比率可能与细胞内自噬囊泡的量呈正相关。Beclin1 是 PI3K 通路一个重要成分[186],是细胞自噬一个重要启动因子,在 LC3-II 组装形成自噬体过程中起到关键性调节作用。在 Beclin1 / 细胞中自噬体可由多层膜构成,而这种形态异常的自噬体也失去了它自身的正常功能。因此 Beclin1的表达量与自噬有着密切关系。Lamp1 是晚期内涵体和溶酶体膜上的一种结构蛋白,能够调控晚期溶酶体膜与自噬体膜相融合的活性,从而调控自噬体的消化活性[143]。
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参考文献(略)
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